Le microbiome intestinal humain sert-il de nouvelle cible thérapeutique personnalisée pour l'athérosclérose coronarienne ?

Introduction:

Le système gastro-intestinal humain est peuplé d'une variété de micro-organismes symbiotiques, à savoir le microbiote. Son poids total est d'environ 2 kilogrammes, contenant des billions de micro-organismes. Le microbiome est l'ensemble des données génétiques (métagénomiques) du microbiote. Ces dernières années, le développement de méthodes efficaces pour le séquençage du génome et la bio-informatique a permis une quantification et une qualification rapides et précises du microbiome, faisant de l'analyse du microbiome une méthode de pointe pour la recherche sur le microbiote.

La maladie coronarienne (CAD) représentait plus de 8 millions de décès chaque année dans le monde. En particulier, le syndrome coronarien aigu (SCA) reste une cause majeure de morbidité et de mortalité et est responsable de plus d'un million d'hospitalisations aux États-Unis chaque année. La caractéristique physiopathologique du SCA est la thrombose coronarienne causée par une lésion de la plaque d'athérosclérose, deux types de lésions étant décrits. Le premier est la rupture de plaque, qui reste la cause la plus fréquente d'athérothrombose coronarienne, et le second est l'érosion superficielle de la plaque, reconnue de plus en plus fréquemment. Contrairement à la rupture de plaque, les lésions causées par l'érosion n'ont pas de fines coiffes fibreuses, de cellules inflammatoires abondantes ou un gros noyau lipidique, mais plutôt riche en matrice extracellulaire, comme les protéoglycanes et les glycosaminoglycanes.

Les études d'imagerie telles que l'angiographie coronarienne par tomodensitométrie (CCTA) et les cathétérismes coronariens diagnostiques avec ou sans tomographie par cohérence optique (OCT) sont de plus en plus utilisées dans la pratique clinique afin de caractériser le mécanisme responsable de la plaque athérosclérotique instable/vulnérable.

Le microbiote intestinal humain interagit largement avec l'hôte par le biais d'échanges métaboliques et du co-métabolisme des substrats ; contribuent ainsi à une variété de mécanismes métaboliques et immunologiques dans le corps humain. La CAD est un domaine d'intérêt majeur dans la recherche sur le microbiote, et plusieurs découvertes relient le microbiote intestinal à la physiopathologie de la CAD. Premièrement, le microbiote était associé au syndrome métabolique, à savoir l'obésité et la résistance à l'insuline. On suppose que le microbiote intestinal peut augmenter les acides gras à chaîne courte, qui finissent par augmenter l'appétit, provoquant ainsi l'obésité. Une autre hypothèse est que les endotoxines du microbiote intestinal peuvent se transloquer dans la circulation sanguine, provoquant une cascade inflammatoire qui finit par favoriser l'athérosclérose. Deuxièmement, le microbiote peut également jouer un rôle dans le développement de l'athérosclérose. Chez les patients atteints d'athérosclérose symptomatique, il existe un modèle de microbiome unique qui peut avoir des caractéristiques pro-inflammatoires. Récemment, un modèle microbien unique a été trouvé chez les patients présentant un profil de risque cardiovasculaire élevé. Troisièmement, le microbiote intestinal métabolise la phosphatidylcholine alimentaire (lécitine) pour produire le métabolite triméthylamine-N-oxyde (TMAO), qui est associé à un risque accru d'événements cardiovasculaires.

Les données publiées à ce jour concernent uniquement l'interaction entre le microbiome intestinal humain et les facteurs de risque cardiovasculaire. Au meilleur des connaissances et de la compréhension de l'investigateur, l'analyse du microbiome des patients avec un diagnostic établi de coronaropathie (y compris le SCA) fait défaut.

Objectifs:

L'objectif de la présente étude est d'étudier le microbiote intestinal des patients atteints de coronaropathie symptomatique, à la fois en phase stable et en phase aiguë. Les chercheurs émettent l'hypothèse que les participants à l'étude présenteraient une signature microbiome unique qui pourrait fournir un nouvel aperçu de la physiopathologie de la coronaropathie athérosclérotique tout en offrant des implications thérapeutiques putatives.

Après avoir établi la signature unique du microbiome dans une grande cohorte de patients atteints de coronaropathie, les chercheurs la corréleraient aux niveaux de TMAO pour étudier plus avant son rôle dans la physiopathologie de la coronaropathie. Au stade final, les chercheurs essaieraient de trouver des moyens d'ajuster les options de traitement personnalisées pour modifier le microbiote intestinal "pro-athéroscléreux". En utilisant les données de l'étude actuelle avec la cohorte précédente de 1000 patients des chercheurs avec un microbiome et un profil nutritionnel connus, il serait en mesure de rechercher une cible spécifique pour une intervention nutritionnelle, telle que les probiotiques. Ensuite, les enquêteurs suivraient les patients avec le séquençage du microbiome après l'intervention nutritionnelle.

Méthodes :

Conception de l'étude et recrutement. Les participants à l'étude seront des patients âgés de 30 à 80 ans arrivant au centre médical de Rabin avec une suspicion de coronaropathie et capables de fournir un consentement éclairé. Les participants fourniront des questionnaires médicaux, de mode de vie et nutritionnels. Des mesures de tension artérielle et de fréquence cardiaque seront prises pendant l'hospitalisation ainsi que des analyses de sang et des prélèvements fécaux et/ou des prélèvements rectaux. Afin d'évaluer et/ou de traiter une suspicion de maladie athéroscléreuse, les participants subiront une tomodensitométrie cardiaque et/ou un cathétérisme cardiaque conformément à la norme de soins et sur la base de la décision du cardiologue traitant. Les diagnostics et les options de traitement seront basés uniquement sur l'état de santé des participants et quel que soit le protocole d'étude susmentionné.

Le groupe témoin sera sélectionné pour représenter un groupe apparié selon l'âge, le sexe et les facteurs de risque cardiovasculaire sans maladie coronarienne actuelle. D'autres critères d'exclusion dans le groupe témoin seront la consommation d'antibiotiques dans les 3 mois suivants, une maladie intestinale inflammatoire ou une autre maladie chronique importante pouvant influencer le microbiote (comme le cancer, une maladie auto-immune et un traitement immunosuppresseur chronique). Le groupe témoin subira un scanner cardiaque ou une angiographie coronarienne en fonction de la suspicion clinique afin d'exclure la coronaropathie et quel que soit le protocole d'étude.

Échantillons de sang. 10 ml de sang veineux seront prélevés dans des tubes contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et du gel avec un activateur de caillots chez les patients inscrits chez tous les participants à l'étude. Les concentrations sériques de créatinine, de troponine, de créatine phosphokinase (CPK), d'hémoglobine, de triglycérides (TG), de cholestérol total (TC), de lipoprotéines de haute densité (HDL), de lipoprotéines de basse densité (LDL), de glucose, de protéine c-réactive ( CRP), le peptide natriurétique de type b (BNP) et l'hémoglobine A1c (HbA1C) seront mesurés par un analyseur biochimique automatique.

De plus, les niveaux de TMAO seront mesurés à partir du plasma sanguin en utilisant la chromatographie liquide ultra-haute performance - la spectrométrie de masse - la surveillance des réactions multiples (UHPLC-MS/MRM) comme décrit précédemment.

Profil nutritionnel. Tous les participants rapporteront leurs habitudes de consommation alimentaire en remplissant le questionnaire de fréquence alimentaire (FFQ).

Analyse CT cardiaque. Les participants sélectionnés subiront une angiographie CT pour l'évaluation et la quantification de la CAD à l'aide d'un système à 256 coupes (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Les données seront acquises avec une collimation de 96 X 0,625 mm et un temps de rotation du portique de 330 ms. L'injection intraveineuse de 60 à 90 ml de produit de contraste non ionique à un débit de 5 ml/s sera suivie d'un bolus salin de chasse de 30 ml (3 ml/s). L'acquisition sera effectuée lors d'une apnée inspiratoire tandis que l'électrocardiogramme sera enregistré simultanément pour permettre, en fonction de la fréquence cardiaque, une synchronisation rétrospective ou prospective des données. Toutes les images seront reconstruites avec une épaisseur de tranche de 0,67 mm et un incrément de tranche de 0,34 mm. L'ensemble de données complet sera transmis à un poste de travail CT dédié avec un outil de reconstruction tridimensionnelle spécialement conçu pour l'angiographie coronarienne (Philips Intellispace Portal, version 7.0) pour permettre des reformations multiplanaires et une analyse quantitative de la plaque. Un lecteur indépendant examinera toutes les études. Chaque vaisseau contenant une sténose significative sera analysé dans des images reformatées multiplanaires courbes en vues grand axe et en coupe. Les diamètres au site de la sténose maximale et aux références proximales et distales seront mesurés. Le degré de sténose sera calculé comme le rapport de la différence entre le diamètre à la sténose maximale et la moyenne des diamètres aux références proximale et distale divisé par la moyenne des diamètres aux références proximale et distale et exprimé en pourcentage. L'indice de remodelage sera calculé comme la surface externe du vaisseau au site de la sténose maximale divisée par la moyenne des surfaces externes du vaisseau aux références proximale et distale. Un remodelage positif sera défini comme un indice de remodelage ≥ 1,05. Le volume de la plaque sera automatiquement calculé comme le volume de tous les voxels segmentés entre les limites luminale et externe des vaisseaux sur des images reformatées multiplanaires courbes. Des références proximales et distales seront utilisées comme extrémités proximale et distale des plaques. Les enquêteurs rapporteront le volume total de plaque et les volumes des sous-types de plaque : plaques calcifiées, non calcifiées et mixtes.

Cathétérisme cardiaque et intervention coronarienne percutanée (ICP). Les patients seront admis au laboratoire de cathétérisme en fonction de leur présentation clinique, en tenant compte des directives cliniques actuelles de l'ESC/AHA. La procédure de cathétérisme cardiaque sera réalisée en utilisant des techniques percutanées standard via l'artère radiale ou fémorale. Les lésions coronaires seront évaluées par l'opérateur en termes de sténose par estimation visuelle ou autre à l'aide de mesures objectives, telles que l'analyse coronarienne quantitative (QCA). L'intervention coronarienne, y compris l'angioplastie par ballonnet et l'implantation d'un stent, sera mise en œuvre selon les besoins et en fonction de la gravité de la sténose coronarienne, c'est-à-dire (sténose de diamètre ≥ 70 %). Une imagerie coronarienne complémentaire (OCT ou échographie intravasculaire) sera réalisée à la discrétion de l'opérateur et quel que soit le protocole d'étude. Tous les patients seront traités au cours de la procédure avec une anticoagulation (principalement de l'héparine non fractionnée) en surveillant attentivement le temps de coagulation activé entre 250 et 300 secondes. Après l'intervention d'angioplastie, tous les patients seront traités par une bithérapie antiplaquettaire associant aspirine et inhibiteur de P2Y12 (clopidogrel, prasugrel ou ticagrelor, selon l'indication clinique) pendant 6 à 12 mois, sauf contre-indication telle que traitement par anticoagulants oraux.

Extraction et filtrage de l'ADN génomique. L'ADN génomique des échantillons de selles sera purifié à l'aide du kit d'isolement d'ADN de sol PowerMag (MoBio) optimisé pour la plate-forme automatisée Tecan. Pour le séquençage shotgun, 100 ng d'ADN purifié seront cisaillés avec un sonicateur Covaris E220X.

Analyse du microbiote. Les échantillons de microbiome seront traités par un pipeline robotisé automatisé au format 96 puits. Chaque groupe d'échantillons collecté sera traité de manière robotique pour le séquençage 16S et métagénomique.

Génération de fonctionnalités basées sur le microbiome. Les chercheurs utiliseront et étendront davantage un pipeline informatique qui a été développé pour générer un riche ensemble de caractéristiques à partir d'un échantillon métagénomique. Ces caractéristiques serviront de base aux modèles qui identifient les signatures basées sur le microbiome.

Abondances bactériennes et virales - Cartographier l'échantillon de métagénome à une base de données de génome bactérien de référence, puis compter le nombre de lectures cartographiant chaque bactérie, ce qui donne un vecteur d'abondances bactériennes relatives pour chaque échantillon.

Diversité bactérienne - En utilisant les abondances bactériennes relatives dérivées ci-dessus, les chercheurs calculeront plusieurs mesures de la diversité des bactéries et des virus dans un échantillon de métagénome (par exemple, l'entropie de Shannon du vecteur d'abondance relative, le nombre de bactéries au-dessus d'un niveau d'abondance minimal), comme la diversité des échantillons s'est avérée être associée à certains aspects physiologiques de l'hôte tels que l'adiposité globale et la résistance à l'insuline.

Taux de croissance bactérienne - Pour chaque échantillon de métagénome, les chercheurs calculeront un vecteur qui correspond au taux de croissance de chaque bactérie dans l'échantillon, en utilisant une nouvelle méthode qui a été récemment développée à cette fin. En bref, en examinant le schéma de séquençage de la couverture de lecture (profondeur) sur toute la longueur de différents génomes bactériens, les chercheurs ont découvert que de nombreuses bactéries présentent un schéma de couverture prototypique, composé d'un seul creux et d'un seul pic. Notamment, l'emplacement du pic coïncide avec l'origine de réplication connue de la bactérie, ce qui suggère que la couverture de lecture ajoutée près du pic représente l'ADN nouvellement répliqué. Pour une bactérie donnée, le rapport entre la couverture maximale et la couverture minimale varie considérablement d'un échantillon à l'autre de différents microbiomes intestinaux humains, les rapports élevés étant similaires à ceux obtenus pendant la phase de croissance exponentielle des bactéries cultivées en culture, et les rapports faibles étant similaires à la croissance en milieu stationnaire. phase.

Abondances de gènes - Les chercheurs calculeront les abondances relatives de gènes dans des échantillons de métagénome en appliquant une approche similaire à celle ci-dessus pour dériver des abondances relatives de bactéries. À cette fin, plutôt que de cartographier les lectures dans la base de données de référence sur le génome bactérien, les chercheurs les cartographieront dans une base de données de référence de gènes bactériens récemment étendue et contenant collectivement plus de 3 millions de gènes bactériens distincts. Les vecteurs d'abondance de gènes dérivés sont complémentaires des vecteurs d'abondance de bactéries, avec l'avantage d'être cartographiés sur des gènes dont le génome bactérien enrobé est inconnu et permettant ainsi de cartographier davantage de lectures de séquençage de métagénome, et avec l'inconvénient de produire un vecteur de caractéristiques beaucoup plus grand.

Abondances des voies biologiques - Comme autre ensemble de caractéristiques fournissant des informations au niveau fonctionnel du microbiote, les chercheurs utiliseront la base de données KEGG des voies biologiques51 et le vecteur ci-dessus de l'abondance des gènes de chaque échantillon pour calculer un score d'abondance pour chaque voie biologique. Le principal avantage de cet ensemble de caractéristiques est que ses associations fournissent des hypothèses directes concernant les mécanismes sous-jacents par lesquels le microbiote peut être impliqué avec le phénotype corrélé.

Stockage des échantillons. Les échantillons ainsi que l'ADN restant et les sérums congelés seront stockés dans des congélateurs à -80°C. Les échantillons de selles non traités (par exemple, tous les échantillons prélevés chaque année ne seront pas traités initialement) seront également stockés dans des congélateurs à -800 °C.

Analyses statistiques. Les données cliniques telles que les signes vitaux, les facteurs de risque cardiovasculaire (âge, sexe, profil lipidique, index glycémique, statut tabagique, antécédent de coronaropathie), les comorbidités chroniques, la consommation régulière de médicaments, les résultats d'imagerie par tomodensitométrie cardiaque et/ou cathétérisme cardiaque ainsi que les niveaux d'enzymes cardiaques seront recueillis au Rabin Medical Center. A l'institut des sciences Weizmann, dans le département d'informatique du Segal Lab, les enquêteurs vont analyser les données. Pour chaque paramètre, une analyse d'association sera effectuée pour identifier tous les paramètres du microbiome qui sont associés à ces paramètres cliniques.

Après avoir analysé les signatures du microbiome chez ces patients, où des interventions probiotiques et/ou nutritionnelles connues peuvent conduire au changement souhaité, les enquêteurs interviendront puis surveilleront le séquençage du microbiome après l'intervention.