Toimiiko ihmisen suolen mikrobiomi uudenlaisena yksilöllisenä terapeuttisena kohteena sepelvaltimon ateroskleroosille?

Esittely:

Ihmisen ruoansulatuskanava on asutettu useilla symbioottisilla mikro-organismeilla, nimittäin mikrobiotalla. Sen kokonaispaino on noin 2 kiloa, ja se sisältää biljoonia mikro-organismeja. Mikrobiomi on mikrobiotan geneettinen (metagenominen) kokonaistieto. Viime vuosina tehokkaiden genomin sekvensoinnin ja bioinformatiikan menetelmien kehittäminen on mahdollistanut mikrobiomin nopean ja tarkan kvantifioinnin ja pätevöinnin, mikä on tehnyt mikrobiomianalyysistä johtavan mikrobiotatutkimuksen menetelmän.

Sepelvaltimotauti (CAD) aiheutti vuosittain yli 8 miljoonan kuolemantapauksen maailmanlaajuisesti. Erityisesti akuutti sepelvaltimon oireyhtymä (ACS) on edelleen merkittävä sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy, ja se on vastuussa yli miljoonasta sairaalahoidosta Yhdysvalloissa vuosittain. ACS:n patofysiologinen tunnusmerkki on ateroskleroottisen plakkivaurion aiheuttama sepelvaltimotukos, jossa kuvataan kahden tyyppisiä vammoja. Ensimmäinen on plakin repeämä, joka on edelleen sepelvaltimotromboosin yleisin syy, ja toinen on pinnallinen plakin eroosio, joka tunnistetaan yhä useammin. Toisin kuin plakin repeämä, eroosion aiheuttamissa leesioissa ei ole ohuita kuituhattuja, runsaasti tulehdussoluja tai suurta lipidiydintä, vaan pikemminkin runsaasti solunulkoista matriisia, kuten proteoglykaaneja ja glykosaminoglykaaneja.

Kuvantamistutkimuksia, kuten sepelvaltimon tietokonetomografiaangiografiaa (CCTA) ja diagnostisia sepelvaltimon katetrointia optisella koherenssitomografialla (OCT) tai ilman sitä, käytetään yhä enemmän kliinisessä käytännössä epästabiilista/haavoittuvasta ateroskleroottisesta plakista vastuussa olevan mekanismin karakterisoimiseksi.

Ihmisen suoliston mikrobiota on laajasti vuorovaikutuksessa isännän kanssa metabolisen vaihdon ja substraattien yhteisaineenvaihdunnan kautta; myötävaikuttavat siten moniin ihmiskehon metabolisiin ja immunologisiin mekanismeihin. CAD on tärkeä kiinnostuksen kohde mikrobiotatutkimuksessa, ja on tehty useita havaintoja, jotka yhdistävät suoliston mikrobiston CAD-patofysiologiaan. Ensinnäkin mikrobiota yhdistettiin metaboliseen oireyhtymään, nimittäin liikalihavuuteen ja insuliiniresistenssiin. Oletetaan, että suoliston mikrobisto voi lisätä lyhytketjuisia rasvahappoja, mikä lopulta lisää ruokahalua ja aiheuttaa siten liikalihavuutta. Toinen hypoteesi on, että suoliston mikrobiotan endotoksiinit voivat siirtyä verenkiertoon ja saada aikaan tulehduksellisia kaskadeja, jotka lopulta edistävät ateroskleroosia. Toiseksi mikrobiotalla voi myös olla rooli ateroskleroosin kehittymisessä. Potilailla, joilla on oireinen ateroskleroosi, on ainutlaatuinen mikrobiomimalli, jolla voi olla tulehdusta edistäviä ominaisuuksia. Äskettäin ainutlaatuinen mikrobikuvio löydettiin potilailta, joilla on korkea kardiovaskulaarinen riskiprofiili. Kolmanneksi suoliston mikrobiota metaboloi ruokavaliosta saatavaa fosfatidyylikoliinia (lesitiiniä) tuottaakseen trimetyyliamiini-N-oksidin (TMAO) metaboliitin, joka liittyy lisääntyneeseen kardiovaskulaaristen tapahtumien riskiin.

Tähän mennessä julkaistut tiedot koskevat yksinomaan ihmisen suoliston mikrobiomin ja kardiovaskulaaristen riskitekijöiden välistä vuorovaikutusta. Tutkijan parhaan tietämyksen ja ymmärryksen mukaan potilaiden, joilla on vakiintunut CAD-diagnoosi (mukaan lukien ACS), mikrobiomianalyysi puuttuu.

Tavoitteet:

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tutkia oireisen CAD-potilaiden suoliston mikrobiotaa sekä vakaassa että akuutissa vaiheessa. Tutkijat olettavat, että tutkimuksen osallistujilla olisi ainutlaatuinen mikrobiomitunnus, joka voi tarjota uudenlaisen käsityksen ateroskleroottisen CAD:n patofysiologiasta samalla, kun sillä on oletettuja terapeuttisia vaikutuksia.

Saatuaan ainutlaatuisen mikrobiomin allekirjoituksen suuressa CAD-potilaiden ryhmässä tutkijat korreloivat sen TMAO-tasoihin tutkiakseen edelleen sen osuutta CAD:n patofysiologiassa. Viimeisessä vaiheessa tutkijat yrittäisivät löytää tapoja muokata yksilöllisiä hoitovaihtoehtoja "pro-ateroskleroottisen" suoliston mikrobiston muuttamiseksi. Käyttämällä tämänhetkisen tutkimuksen tietoja tutkijoiden edellisen 1000 potilasryhmän kanssa, jolla on tunnettu mikrobiomi ja ravitsemusprofiili, se voisi etsiä erityistä kohdetta ravitsemusinterventiolle, kuten probiooteille. Sitten tutkijat seurasivat potilaita sekvensoimalla mikrobiomia ravitsemustoimenpiteen jälkeen.

Menetelmät:

Opintojen suunnittelu ja rekrytointi. Tutkimukseen osallistuvat 30–80-vuotiaat potilaat, jotka saapuvat Rabinin lääketieteelliseen keskukseen, joilla on epäilty CAD ja jotka voivat antaa tietoisen suostumuksen. Osallistujat tarjoavat lääketieteellisiä, elämäntapa- ja ravitsemuskyselyitä. Sairaalahoidon aikana otetaan verenpaine- ja sykemittaukset sekä verikokeet ja ulostenäytteet ja/tai peräsuolen pyyhkäisynäytteet. Epäillyn ateroskleroottisen sairauden arvioimiseksi ja/tai hoitamiseksi osallistujille tehdään sydämen TT ja/tai sydänkatetrointi hoitostandardien mukaisesti ja hoitavan kardiologin päätöksen perusteella. Diagnostiikka- ja hoitovaihtoehdot perustuvat vain osallistujien terveydentilaan ja edellä mainitusta tutkimusprotokollasta riippumatta.

Kontrolliryhmä valitaan edustamaan ikää, sukupuolta ja kardiovaskulaarisia riskitekijöitä vastaavaa ryhmää, jolla ei ole nykyistä CAD:tä. Muita poissulkemiskriteereitä kontrolliryhmässä ovat antibioottien käyttö seuraavan 3 kuukauden aikana, tulehduksellinen suolistosairaus tai muu merkittävä krooninen sairaus, joka voi vaikuttaa mikrobiotaan (kuten syöpä, autoimmuunisairaus ja krooninen immunosuppressiohoito). Kontrolliryhmälle tehdään sydämen CT tai sepelvaltimon angiografia kliinisen epäilyn mukaan CAD:n poissulkemiseksi ja tutkimusprotokollasta riippumatta.

Verinäytteitä. Kaikilta tutkimukseen osallistuneilta potilailta kerätään 10 ml laskimoverta etyleenidiamiinitetraetikkahappoon (EDTA) ja geeliin, jossa on hyytymisaktivaattoria sisältäviä putkia. Seerumin kreatiniinin, troponiinin, kreatiinifosfokinaasin (CPK), hemoglobiinin, triglyseridien (TG), kokonaiskolesterolin (TC), korkeatiheyksisten lipoproteiinien (HDL), matalatiheyksisten lipoproteiinien (LDL), glukoosin, c-reaktiivisen proteiinin ( CRP), b-tyypin natriureettinen peptidi (BNP) ja hemoglobiini A1c (HbA1C) mitataan automaattisella biokemian analysaattorilla.

Lisäksi TMAO-tasot mitataan veriplasmasta käyttämällä Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) -tekniikkaa, kuten aiemmin on kuvattu.

Ravitsemusprofilointi. Kaikki osallistujat raportoivat ruokailutottumuksistaan ​​täyttämällä Food Frequency Questionnaire (FFQ) -kyselyn.

Sydämen CT-analyysi. Valituille osallistujille tehdään CT-angiografia CAD:n arvioimiseksi ja kvantifioimiseksi käyttäen 256-viipaista järjestelmää (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Tiedot saadaan 96 x 0,625 mm:n kollimaatiolla ja portaalin kiertoajalla 330 ms. Laskimonsisäistä 60–90 ml:n ionitonta varjoainetta 5 ml/s virtausnopeudella injektointia seuraa 30 ml:n suolaliuosta chase-bolus (3 ml/s). Keräys suoritetaan sisäänhengityksen pidätyksen aikana, samalla kun elektrokardiogrammi tallennetaan samanaikaisesti, jotta mahdollistetaan tietojen retrospektiivinen tai prospektiivinen portiointi sydämen sykkeestä riippuen. Kaikki kuvat rekonstruoidaan 0,67 mm:n siivupaksuudella ja 0,34 mm:n siivuvälillä. Täydellinen tietojoukko siirretään erityiseen TT-työasemaan, jossa on 3-ulotteinen rekonstruktiotyökalu, joka on erityisesti suunniteltu sepelvaltimon angiografiaan (Philips Intellispace Portal, versio 7.0), jotta voidaan tehdä monitasoisia reformaatioita ja kvantitatiivista plakkianalyysiä. Riippumaton lukija käy läpi kaikki tutkimukset. Jokainen merkittävä ahtauma sisältävä suoni analysoidaan kaarevina monitasoisina uudelleen muotoiltuina kuvina pitkäakseli- ja poikkileikkausnäkymissä. Halkaisijat mitataan suurimman ahtauman kohdasta sekä proksimaalisista ja distaalisista referenssikohdista. Ahtauman aste lasketaan prosentteina jaettuna proksimaalisten ja distaalisten referenssien halkaisijoiden halkaisijoiden ja proksimaalisten ja distaalisten vertailukohtien halkaisijoiden keskiarvon välisen eron suhteena. Uudelleenmuotoiluindeksi lasketaan verisuonen ulkopinta-alalla maksimaalisen ahtauman kohdassa jaettuna verisuonten ulompien alueiden keskiarvolla proksimaalisissa ja distaalisissa referenssikohdissa. Positiivinen uudelleenmuotoilu määritellään uudelleenmuotoiluindeksiksi ≥ 1,05. Plakin tilavuus lasketaan automaattisesti kaarevien monitasoisten uudelleenmuotoiltujen kuvien luminaalisen ja ulkoisen suonen rajan väliin segmentoitujen vokselien tilavuutena. Proksimaalisia ja distaalisia viitteitä käytetään plakkien proksimaalisina ja distaalisina päinä. Tutkijat raportoivat plakin kokonaistilavuuden ja plakkien alatyyppien tilavuudet: kalkkeutuneita, kalkkiutumattomia ja sekaplakkeja.

Sydämen katetrointi ja perkutaaninen sepelvaltimointerventio (PCI). Potilaat otetaan katetrointilaboratorioon kliinisen esityksensä mukaan ottaen huomioon nykyiset ESC/AHA-kliiniset ohjeet. Sydämen katetrointi suoritetaan käyttämällä tavallisia perkutaanisia tekniikoita radiaali- tai reisivaltimon kautta. Operaattori arvioi sepelvaltimoleesiot ahtauman perusteella visuaalisella arvioinnilla tai muulla tavalla käyttämällä objektiivisia mittauksia, kuten kvantitatiivista sepelvaltimon analyysiä (QCA). Sepelvaltimon interventio, mukaan lukien palloangioplastia ja stentin implantointi, toteutetaan tarpeen mukaan ja sepelvaltimon ahtauman vakavuuden mukaan eli (≥70 % halkaisijaltaan stenoosi). Täydentävä sepelvaltimon kuvantaminen (OCT tai intravaskulaarinen ultraääni) suoritetaan käyttäjän harkinnan mukaan ja tutkimusprotokollasta riippumatta. Kaikkia potilaita hoidetaan toimenpiteen aikana antikoagulaatiolla (enimmäkseen fraktioimatonta hepariinia) ja aktiivista hyytymisaikaa tarkkaillaan tarkasti välillä 250-300 sekuntia. Angioplastian jälkeen kaikkia potilaita hoidetaan kaksoisverihiutaleiden vastaisella hoidolla, jossa yhdistetään aspiriinia ja P2Y12-estäjää (klopidogreeli, prasugreeli tai tikagrelori kliinisen käyttöaiheen mukaan) 6-12 kuukauden ajan, ellei siihen ole vasta-aiheita, kuten esim. hoito oraalisilla antikoagulantteilla.

Genomisen DNA:n erottaminen ja suodatus. Ulostenäytteistä peräisin oleva genominen DNA puhdistetaan PowerMag Soil DNA -eristyssarjalla (MoBio), joka on optimoitu Tecanin automatisoidulle alustalle. Haulikon sekvensointia varten 100 ng puhdistettua DNA:ta leikataan Covaris E220X -sonikaattorilla.

Mikrobiomianalyysi. Mikrobiominäytteet käsitellään automatisoidulla robottiputkilinjalla 96-kuoppaisessa muodossa. Jokainen kerätty näyteryhmä käsitellään robotilla sekä 16S- että metagenomista sekvensointia varten.

Mikrobiomiin perustuvien ominaisuuksien luominen. Tutkijat käyttävät ja laajentavat edelleen laskennallista putkistoa, joka on kehitetty luomaan runsaasti ominaisuuksia metagenomisesta näytteestä. Nämä ominaisuudet muodostavat perustan malleille, jotka tunnistavat mikrobiomipohjaisia ​​allekirjoituksia.

Bakteerien ja virusten runsaudet – Metagegenominäytteen kartoittaminen referenssibakteerigenomitietokantaan ja kunkin bakteerin kartoituslukujen laskeminen, mikä johtaa kunkin näytteen suhteellisten bakteerimäärien vektoriin.

Bakteerien monimuotoisuus – Käyttäen yllä saatuja suhteellisia bakteerimääriä, tutkijat laskevat useita bakteerien ja virusten monimuotoisuuden mittareita metagenominäytteessä (esim. Shannonin suhteellisen runsausvektorin entropia, bakteerien määrä jonkin vähimmäismäärän yläpuolella), kuten näytteiden monimuotoisuuden osoitettiin liittyvän tiettyihin isännän fysiologisiin näkökohtiin, kuten yleiseen rasvaisuuteen ja insuliiniresistenssiin.

Bakteerien kasvunopeudet - Tutkijat laskevat kullekin metagenominäytteelle vektorin, joka vastaa kunkin näytteen bakteerin kasvunopeutta, käyttämällä uutta menetelmää, joka on äskettäin kehitetty tähän tarkoitukseen. Lyhyesti sanottuna, tutkimalla sekvensoinnin lukupeittomallia (syvyys) eri bakteerigenomien pituudelta, tutkijat havaitsivat, että monilla bakteereilla on prototyyppinen peittokuvio, joka koostuu yhdestä kourusta ja yhdestä huipusta. Erityisesti piikin sijainti on sama kuin bakteerin tunnettu replikaation aloituskohta, mikä viittaa siihen, että lisätty lukupeitto piikin lähellä edustaa juuri replikoitunutta DNA:ta. Jokaisen tietyn bakteerin osalta huipun ja alimman peittoalueen välinen suhde vaihtelee suuresti eri ihmisen suoliston mikrobiomeista otettujen näytteiden välillä, ja korkeat suhteet ovat samanlaisia ​​kuin viljelmässä kasvatettujen bakteerien eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa saadut suhteet, ja alhaiset suhteet ovat samanlaisia ​​kuin kasvussa paikallaan. vaihe.

Geenien määrä - Tutkijat laskevat geenien suhteellisen runsauden metagenominäytteissä soveltamalla samanlaista lähestymistapaa kuin edellä bakteerien suhteellisen runsauden johtamiseen. Tätä tarkoitusta varten tutkijat kartoittavat lukemat referenssibakteerigenomitietokantaan, vaan ne kartoittavat ne bakteerigeenien viitetietokantaan, jota on hiljattain laajennettu ja joka sisältää yhteensä yli 3 miljoonaa erillistä bakteerigeeniä. Johdetut geenien runsausvektorit ovat komplementaarisia bakteerien runsausvektoreiden kanssa, ja sen etuna on kartoittaminen geeneihin, joiden bakteerigenomia ei tunneta, ja siten mahdollistaa useamman metagenomin sekvensointilukemisen kartoittamisen, ja haittana on paljon suuremman piirrevektorin tuottaminen.

Biologisten reittien runsaus - Toisena joukona ominaisuuksia, jotka tarjoavat tietoa mikrobiotan toiminnallisella tasolla, tutkijat käyttävät biologisten reittien KEGG-tietokantaa51 ja yllä olevaa kunkin näytteen geenien runsausvektoria laskeakseen kunkin biologisen reitin runsauspistemäärän. Tämän ominaisuusjoukon tärkein etu on, että sen assosiaatiot tarjoavat suoria hypoteeseja taustalla olevista mekanismeista, joiden kautta mikrobiota voi olla mukana korreloivan fenotyypin kanssa.

Näytteiden säilytys. Näytteet sekä jäljelle jäänyt DNA ja pakastetut seerumit säilytetään -80C pakastimissa. Käsittelemättömät ulostenäytteet (esim. kaikkia vuosittain kerättyjä näytteitä ei käsitellä aluksi) säilytetään myös -800 C pakastimissa.

Tilastollinen analyysi. Kliiniset tiedot, kuten elintoiminnot, kardiovaskulaariset riskitekijät (ikä, sukupuoli, lipidiprofiili, glykeeminen indeksi, tupakointitila, aiempi CAD), krooniset rinnakkaissairaudet, säännöllinen huumeiden käyttö, kuvantamislöydökset sydämen TT:stä ja/tai sydämen katetroista sekä sydämen entsyymitasot kerätään Rabin Medical Centerissä. Weizmannin tiedeinstituutin Segal Labin tietojenkäsittelytieteen osastolla tutkijat analysoivat tiedot. Kullekin parametrille suoritetaan assosiaatioanalyysit kaikkien näihin kliinisiin parametreihin liittyvien mikrobiomiparametrien tunnistamiseksi.

Analysoituaan mikrobiomimerkinnät niillä potilailla, joissa tunnetut probiootti- ja/tai ravitsemustoimenpiteet voivat johtaa haluttuun muutokseen, tutkijat puuttuvat asiaan ja seuraavat mikrobiomia sekvensoimalla toimenpiteen jälkeen.