Служит ли микробиом кишечника человека новой персонализированной терапевтической мишенью при коронарном атеросклерозе?

Введение:

Желудочно-кишечный тракт человека населен разнообразными симбиотическими микроорганизмами, а именно микробиотой. Его общий вес составляет примерно 2 килограмма, он содержит триллионы микроорганизмов. Микробиом представляет собой совокупность генетических (метагеномных) данных микробиоты. В последние годы разработка эффективных методов секвенирования генома и биоинформатики позволила провести быструю и точную количественную оценку и квалификацию микробиома, сделав анализ микробиома ведущим методом исследования микробиоты.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) ежегодно уносит более 8 миллионов смертей во всем мире. В частности, острый коронарный синдром (ОКС) остается основной причиной заболеваемости и смертности и является причиной более 1 миллиона госпитализаций в США ежегодно. Патофизиологическим признаком ОКС является тромбоз коронарных артерий, вызванный повреждением атеросклеротической бляшки, при этом описаны два типа повреждений. Первый — это разрыв бляшки, который остается наиболее частой причиной коронарного атеротромбоза, а второй — поверхностная эрозия бляшки, которая распознается все чаще. В отличие от разрыва бляшки, поражения, вызванные эрозией, не имеют тонких фиброзных шапочек, большого количества воспалительных клеток или большого липидного ядра, а скорее богаты внеклеточным матриксом, таким как протеогликаны и гликозаминогликаны.

Визуализирующие исследования, такие как коронарная компьютерная томографическая ангиография (ККТ) и диагностическая коронарная катетеризация с оптической когерентной томографией (ОКТ) или без нее, все чаще используются в клинической практике для характеристики механизма, ответственного за нестабильную/уязвимую атеросклеротическую бляшку.

Микробиота кишечника человека активно взаимодействует с хозяином посредством метаболического обмена и ко-метаболизма субстратов; тем самым способствуют разнообразию метаболических и иммунологических механизмов в организме человека. ИБС является основной областью исследований микробиоты, и было сделано несколько выводов, связывающих микробиоту кишечника с патофизиологией ИБС. Во-первых, микробиота была связана с метаболическим синдромом, а именно с ожирением и резистентностью к инсулину. Предполагается, что кишечная микробиота может увеличивать содержание короткоцепочечных жирных кислот, что в конечном итоге повышает аппетит, вызывая ожирение. Другая гипотеза состоит в том, что эндотоксины микробиоты кишечника могут перемещаться в кровоток, вызывая воспалительный каскад, который в конечном итоге способствует развитию атеросклероза. Во-вторых, микробиота также может играть роль в развитии атеросклероза. У пациентов с симптоматическим атеросклерозом существует уникальный паттерн микробиома, который может иметь провоспалительные характеристики. Недавно среди пациентов с высоким профилем сердечно-сосудистого риска был обнаружен уникальный микробный паттерн. В-третьих, кишечная микробиота метаболизирует пищевой фосфатидилхолин (лецитин) с образованием метаболита триметиламин-N-оксида (ТМАО), который связан с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний.

Опубликованные до сих пор данные относятся исключительно к взаимодействию между микробиомом кишечника человека и факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. Насколько известно и понятно исследователю, анализ микробиома пациентов с установленным диагнозом ИБС (включая ОКС) отсутствует.

Цели:

Целью настоящего исследования является изучение микробиоты кишечника у пациентов с симптоматической ИБС как в стабильной, так и в острой фазах. Исследователи предполагают, что участники исследования будут иметь уникальную сигнатуру микробиома, которая может обеспечить новое понимание патофизиологии атеросклеротической ИБС, а также предполагаемые терапевтические последствия.

После установления уникальной сигнатуры микробиома у большой когорты пациентов с ИБС исследователи сопоставили ее с уровнями ТМАО для дальнейшего изучения его роли в патофизиологии ИБС. На заключительном этапе исследователи попытаются найти способы скорректировать персонализированные варианты лечения, чтобы изменить «проатеросклеротическую» микробиоту кишечника. Используя данные текущего исследования с предыдущей когортой исследователей из 1000 пациентов с известным микробиомом и профилем питания, можно было бы найти конкретную цель для нутритивного вмешательства, такого как пробиотики. Затем исследователи будут наблюдать за пациентами с секвенированием микробиома после диетического вмешательства.

Методы:

Исследование дизайна и найма. Участниками исследования будут пациенты в возрасте от 30 до 80 лет, поступающие в медицинский центр им. Рабина с подозрением на ИБС и способные дать информированное согласие. Участники предоставят медицинские анкеты, вопросы образа жизни и питания. Во время госпитализации будут проводиться измерения артериального давления и частоты сердечных сокращений, а также анализы крови, образцы кала и/или ректальные мазки. Для оценки и/или лечения пациентов с подозрением на атеросклеротическое заболевание проводится КТ сердца и/или катетеризация сердца в соответствии со стандартом медицинской помощи и на основании решения лечащего кардиолога. Диагностика и варианты лечения будут основываться только на состоянии здоровья участников и независимо от вышеупомянутого протокола исследования.

Будет выбрана контрольная группа, представляющая группу, соответствующую возрасту, полу и факторам сердечно-сосудистого риска без текущей ИБС. Дополнительными критериями исключения в контрольной группе будут потребление антибиотиков в течение следующих 3 месяцев, воспалительное заболевание кишечника или другое серьезное хроническое заболевание, которое может повлиять на микробиоту (например, рак, аутоиммунное заболевание и хроническое иммуносупрессивное лечение). Контрольная группа будет подвергнута КТ сердца или коронарной ангиографии в соответствии с клиническим подозрением, чтобы исключить ИБС и независимо от протокола исследования.

Образцы крови. 10 мл венозной крови будут собраны в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и гелем с активатором свертывания у включенных пациентов у всех участников исследования. Концентрации сывороточного креатинина, тропонина, креатинфосфокиназы (КФК), гемоглобина, триглицеридов (ТГ), общего холестерина (ОХ), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), глюкозы, С-реактивного белка ( CRP), натрийуретический пептид b-типа (BNP) и гемоглобин A1c (HbA1C) будут измеряться с помощью автоматического биохимического анализатора.

Кроме того, уровни ТМАО будут измеряться в плазме крови с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии - мониторинга множественных реакций (УВЭЖХ-МС/MRM), как описано ранее.

Пищевое профилирование. Все участники сообщат о своих привычках в потреблении пищи, заполнив анкету частоты приема пищи (FFQ).

Анализ КТ сердца. Отобранные участники пройдут КТ-ангиографию для оценки и количественного определения ИБС с использованием системы из 256 срезов (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Кливленд, Огайо). Данные будут получены с коллимацией 96 X 0,625 мм и временем вращения гентри 330 мс. После внутривенной инъекции от 60 до 90 мл неионогенного контрастного вещества со скоростью потока 5 мл/с последует болюсное введение 30 мл физиологического раствора (3 мл/с). Сбор будет выполняться во время задержки вдоха, в то время как электрокардиограмма будет записываться одновременно, чтобы позволить, в зависимости от частоты сердечных сокращений, ретроспективное или проспективное стробирование данных. Все изображения будут реконструированы с толщиной среза 0,67 мм и шагом среза 0,34 мм. Полный набор данных будет передан на специальную рабочую станцию ​​КТ с инструментом трехмерной реконструкции, специально разработанным для коронарной ангиографии (Philips Intellispace Portal, версия 7.0), чтобы обеспечить многоплоскостное преобразование и количественный анализ бляшек. Независимый читатель рассмотрит все исследования. Каждый сосуд со значительным стенозом будет проанализирован на изогнутых многоплоскостных переформатированных изображениях в проекциях по длинной оси и поперечном сечении. Будут измеряться диаметры в месте максимального стеноза, а также в проксимальной и дистальной точках. Степень стеноза будет рассчитываться как отношение разницы между диаметром при максимальном стенозе и средним значением диаметров в проксимальной и дистальной точках, деленное на среднее значение диаметров в проксимальной и дистальной точках и выраженное в процентах. Индекс ремоделирования будет рассчитываться как площадь наружного сосуда в месте максимального стеноза, деленная на среднее значение площади наружного сосуда в проксимальном и дистальном направлениях. Положительное ремоделирование будет определяться как индекс ремоделирования ≥ 1,05. Объем бляшки будет автоматически рассчитан как объем всех вокселей, сегментированных между просветной и внешней границами сосудов на изогнутых многоплоскостных переформатированных изображениях. Проксимальный и дистальный ориентиры будут использоваться как проксимальный и дистальный концы бляшек. Исследователи сообщат об общем объеме бляшек и объемах подтипов бляшек: кальцифицированных, некальцинированных и смешанных бляшек.

Катетеризация сердца и чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ). Пациенты будут госпитализированы в лабораторию катетеризации в соответствии с их клинической картиной, принимая во внимание текущие клинические рекомендации ESC/AHA. Процедура катетеризации сердца будет проводиться с использованием стандартных чрескожных методов через лучевую или бедренную артерию. Поражения коронарных артерий будут оцениваться оператором с точки зрения стеноза с помощью визуальной оценки или других объективных измерений, таких как количественный коронарный анализ (QCA). Коронарное вмешательство, включая баллонную ангиопластику и имплантацию стента, будет осуществляться по мере необходимости и в соответствии с тяжестью коронарного стеноза, т.е. (стеноз ≥70% диаметра). Дополнительная визуализация коронарных артерий (ОКТ или внутрисосудистое ультразвуковое исследование) будет проводиться по усмотрению оператора и независимо от протокола исследования. Всем пациентам во время процедуры будут назначены антикоагулянты (в основном нефракционированный гепарин) с тщательным мониторингом активированного времени свертывания в пределах 250-300 секунд. После процедуры ангиопластики все пациенты будут получать двойную антитромбоцитарную терапию, сочетающую аспирин и ингибитор P2Y12 (клопидогрел, прасугрел или тикагрелор, в соответствии с клиническими показаниями) в течение 6-12 месяцев, если не будет противопоказаний, таких как лечение пероральными антикоагулянтами.

Экстракция и фильтрация геномной ДНК. Геномная ДНК из образцов стула будет очищена с использованием набора для выделения ДНК PowerMag Soil (MoBio), оптимизированного для автоматизированной платформы Tecan. Для секвенирования дробовиком 100 нг очищенной ДНК будут расщеплены ультразвуковым аппаратом Covaris E220X.

Анализ микробиома. Образцы микробиома будут обрабатываться автоматизированным роботизированным конвейером в 96-луночном формате. Каждая собранная группа образцов будет обработана роботом как для секвенирования 16S, так и для метагеномного секвенирования.

Создание функций на основе микробиома. Исследователи будут использовать и дополнительно расширять вычислительный конвейер, разработанный для создания богатого набора функций из метагеномного образца. Эти функции станут основой для моделей, которые идентифицируют сигнатуры на основе микробиома.

Обилие бактерий и вирусов. Сопоставление образца метагенома с эталонной базой данных бактериального генома, а затем подсчет количества прочтений, сопоставленных с каждой бактерией, в результате чего получается вектор относительной численности бактерий для каждого образца.

Бактериальное разнообразие. Используя относительную численность бактерий, полученную выше, исследователи вычисляют несколько показателей разнообразия бактерий и вирусов в образце метагенома (например, энтропия Шеннона вектора относительной численности, количество бактерий выше некоторого минимального уровня численности), как Было показано, что разнообразие образцов связано с определенными физиологическими аспектами хозяина, такими как общее ожирение и резистентность к инсулину.

Скорость роста бактерий. Для каждого образца метагенома исследователи будут вычислять вектор, соответствующий скорости роста каждой бактерии в образце, используя новый метод, недавно разработанный для этой цели. Вкратце, изучив характер покрытия (глубины) чтения секвенирования по длине различных бактериальных геномов, исследователи обнаружили, что многие бактерии демонстрируют прототипичный образец покрытия, состоящий из одной впадины и одного пика. Примечательно, что расположение пика совпадает с известным источником репликации бактерий, что позволяет предположить, что добавленное покрытие считывания рядом с пиком представляет собой недавно реплицированную ДНК. Для любых данных бактерий соотношение между охватом пика и минимума сильно различается в образцах из разных микробиомов кишечника человека, при этом высокие отношения аналогичны тем, которые получены во время экспоненциальной фазы роста бактерий, выращенных в культуре, а низкие отношения аналогичны росту в стационарных условиях. фаза.

Обилие генов. Исследователи будут вычислять относительное содержание генов в образцах метагенома, применяя подход, аналогичный описанному выше, для получения относительного обилия бактерий. С этой целью вместо сопоставления прочтений с эталонной базой данных бактериального генома исследователи сопоставят их с недавно расширенной эталонной базой данных бактериальных генов, которая в совокупности содержит более 3 миллионов различных бактериальных генов. Полученные векторы обилия генов комплементарны векторам обилия бактерий, с преимуществом, заключающимся в том, что они картируют гены, чей встраивающий бактериальный геном неизвестен, и, таким образом, позволяют картировать больше считываний секвенирования метагенома, а недостатком является получение гораздо большего вектора признаков.

Обилие биологических путей. В качестве еще одного набора функций, которые предоставляют информацию на функциональном уровне микробиоты, исследователи будут использовать базу данных KEGG о биологических путях51 и приведенный выше вектор обилия генов каждого образца для вычисления показателя обилия для каждого биологического пути. Ключевое преимущество этого набора признаков заключается в том, что его ассоциации обеспечивают прямые гипотезы относительно основных механизмов, посредством которых микробиота может быть связана с коррелирующим фенотипом.

Хранение образцов. Образцы, а также оставшаяся ДНК и замороженные сыворотки будут храниться в морозильных камерах при температуре -80°C. Необработанные образцы стула (например, не все образцы, собираемые ежегодно, будут первоначально обработаны) также будут храниться в морозильных камерах при температуре -80°C.

Статистический анализ. Клинические данные, такие как жизненные показатели, факторы сердечно-сосудистого риска (возраст, пол, липидный профиль, гликемический индекс, статус курения, предшествующая ИБС), хронические сопутствующие заболевания, регулярное употребление наркотиков, результаты визуализации при КТ сердца и/или катетеризации сердца, а также уровни сердечных ферментов будут собраны в Медицинском центре Рабина. В научном институте Вейцмана, в отделе компьютерных наук лаборатории Сигала, исследователи будут анализировать данные. Для каждого параметра будет проведен анализ ассоциации, чтобы определить все параметры микробиома, которые связаны с этими клиническими параметрами.

После анализа сигнатур микробиома у тех пациентов, у которых известные пробиотические и/или пищевые вмешательства могут привести к желаемым изменениям, исследователи вмешаются, а затем отслеживают секвенирование микробиома после вмешательства.