Az emberi bélmikrobiom új, személyre szabott terápiás célpontként szolgál a koszorúér atherosclerosis számára?

Bevezetés:

Az emberi gyomor-bélrendszer számos szimbiotikus mikroorganizmussal van benépesítve, nevezetesen a mikrobiotával. Teljes tömege körülbelül 2 kilogramm, mikroorganizmusok billióit tartalmazza. A mikrobióma a mikrobiota teljes genetikai (metagenomikai) adatai. Az elmúlt években a genomszekvenálás és a bioinformatika hatékony módszereinek kifejlesztése lehetővé tette a mikrobiom gyors és pontos kvantifikálását és minősítését, a mikrobióma-analízist a mikrobióta kutatás vezető módszerévé tette.

A koszorúér-betegség (CAD) évente több mint 8 millió halálesetért felelős világszerte. Az akut koronária szindróma (ACS) továbbra is a morbiditás és mortalitás egyik fő oka, és évente több mint 1 millió kórházi felvételért felelős az Egyesült Államokban. Az ACS kórélettani jellemzője az ateroszklerotikus plakk-sérülés által okozott koszorúér-trombózis, amely kétféle sérülést ír le. Az első a plakk ruptura, amely továbbra is a koszorúér-athero-thrombosis leggyakoribb oka, a második pedig a felszíni plakk erózió, amelyet egyre gyakrabban ismernek fel. Ellentétben a plakk felszakadással, az erózió okozta elváltozások nem rendelkeznek vékony rostos kupakokkal, bőséges gyulladásos sejtekkel vagy nagy lipidmaggal, hanem gazdagok extracelluláris mátrixban, például proteoglikánokban és glikozaminoglikánokban.

A klinikai gyakorlatban egyre gyakrabban alkalmazzák a képalkotó vizsgálatokat, mint például a koszorúér-komputertomográfiás angiográfiát (CCTA) és a diagnosztikus koszorúér-katéterezést optikai koherencia-tomográfiával (OCT) vagy anélkül, hogy jellemezzék az instabil/sérülékeny atheroscleroticus plakk kialakulásáért felelős mechanizmust.

Az emberi bél mikrobiota kiterjedt kölcsönhatásba lép a gazdaszervezettel a metabolikus csere és a szubsztrátok együttes metabolizmusa révén; ezáltal hozzájárulnak az emberi szervezet számos metabolikus és immunológiai mechanizmusához. A CAD a mikrobiota kutatásának egyik fő érdeklődési területe, és számos olyan eredmény született, amely összekapcsolja a bélmikrobiótát a CAD patofiziológiájával. Először is, a mikrobiotát a metabolikus szindrómával, nevezetesen az elhízással és az inzulinrezisztenciával társították. Feltételezik, hogy a bél mikrobiota növelheti a rövid szénláncú zsírsavakat, ami végül növeli az étvágyat, így elhízást okoz. Egy másik hipotézis az, hogy a bélmikrobióta endotoxinok átkerülhetnek a véráramba, és gyulladásos kaszkádot válthatnak ki, amely végül elősegíti az érelmeszesedést. Másodszor, a mikrobióta is szerepet játszhat az érelmeszesedés kialakulásában. A tünetekkel járó atherosclerosisban szenvedő betegeknél egyedi mikrobiom-mintázat létezik, amely gyulladást elősegítő tulajdonságokkal rendelkezhet. A közelmúltban egyedülálló mikrobiális mintázatot találtak a magas kardiovaszkuláris kockázati profillal rendelkező betegek körében. Harmadszor, a bél mikrobiota metabolizálja az étrendből származó foszfatidil-kolint (lecitint), hogy a trimetilamin-N-oxid (TMAO) metabolitot termelje, amely a szív- és érrendszeri események fokozott kockázatával jár.

Az eddig közzétett adatok kizárólag az emberi bélmikrobióma és a szív- és érrendszeri kockázati tényezők közötti kölcsönhatásra vonatkoznak. A vizsgáló legjobb tudása és megértése szerint a CAD (beleértve az ACS-t is) megállapított diagnózisú betegek mikrobiomelemzése hiányzik.

Célok:

A jelen tanulmány célja a tünetekkel járó CAD-ben szenvedő betegek bélmikrobiótájának vizsgálata, mind stabil, mind akut fázisban. A kutatók azt feltételezik, hogy a vizsgálatban résztvevők olyan egyedi mikrobiom aláírást mutatnak be, amely új betekintést nyújthat az ateroszklerotikus CAD patofiziológiájába, miközben feltételezett terápiás következményekkel jár.

Miután a CAD-betegek nagy csoportjában megállapították az egyedi mikrobióm aláírást, a kutatók azt korrelálják a TMAO-szintekkel, hogy tovább vizsgálják a CAD patofiziológiájában játszott szerepét. Az utolsó szakaszban a kutatók megpróbálják megtalálni a módját annak, hogy személyre szabott kezelési lehetőségeket állítsanak be, hogy megváltoztassák a "pro-atherosclerotikus" bélmikrobiótát. A jelenlegi vizsgálat adatait felhasználva a kutatók korábbi 1000, ismert mikrobiómával és táplálkozási profillal rendelkező betegcsoportjával, képes lenne konkrét célpontot keresni a táplálkozási beavatkozáshoz, például probiotikumokhoz. Ezt követően a kutatók a táplálkozási beavatkozást követően a mikrobiom szekvenálásával monitorozták a betegeket.

Mód:

Tanulmánytervezés és toborzás. A vizsgálatban résztvevők 30-80 év közötti betegek, akik CAD-gyanúval érkeznek a Rabin Medical Centerbe, és tájékozott beleegyezést tudnak adni. A résztvevők egészségügyi, életmódbeli és táplálkozási kérdőíveket bocsátanak rendelkezésre. A kórházi kezelés során vérnyomás- és pulzusmérést, valamint vérvizsgálatot, székletmintát és/vagy végbéltamponot vesznek. Az érelmeszesedés gyanújának értékelése és/vagy kezelése érdekében a résztvevők szív-CT-n és/vagy szívkatéterezésen esnek át az ellátás színvonalának megfelelően és a kezelő kardiológus döntése alapján. A diagnosztikai és kezelési lehetőségek kizárólag a résztvevők egészségi állapotán alapulnak, függetlenül a fent említett vizsgálati protokolltól.

A kontrollcsoportot úgy választják ki, hogy az életkorban, nemben és kardiovaszkuláris kockázati tényezőkkel megegyező csoportot képviseljen, aktuális CAD nélkül. További kizárási kritérium a kontrollcsoportban az antibiotikum fogyasztás a következő 3 hónapban, gyulladásos bélbetegség vagy más jelentős krónikus betegség, amely befolyásolhatja a mikrobiotát (például rák, autoimmun betegség és krónikus immunszuppresszív kezelés). A kontrollcsoport klinikai gyanúja szerint szív-CT-n vagy koszorúér-angiográfián esik át a CAD kizárása érdekében, függetlenül a vizsgálati protokolltól.

Vérminták. 10 ml vénás vért etilén-diamin-tetraecetsavba (EDTA) és vérrögaktivátort tartalmazó gélbe gyűjtenek a bevont betegektől minden vizsgálati résztvevőnél. A szérum kreatinin, troponin, kreatin-foszfokináz (CPK), hemoglobin, trigliceridek (TG), összkoleszterin (TC), nagy sűrűségű lipoproteinek (HDL), kis sűrűségű lipoproteinek (LDL), glükóz, c-reaktív fehérje koncentrációja A CRP-t, a b-típusú natriuretikus peptidet (BNP) és a hemoglobin A1c-t (HbA1C) automatikus biokémiai analizátor méri.

Ezenkívül a TMAO szintjét a vérplazmából mérik az Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) segítségével, a korábban leírtak szerint.

Táplálkozási profilalkotás. Minden résztvevő beszámol az étkezési szokásairól a Food Frequency Questionnaire (FFQ) kitöltésével.

Szív CT elemzés. A kiválasztott résztvevők CT-angiográfián esnek át a CAD értékeléséhez és mennyiségi meghatározásához egy 256 szeletes rendszerrel (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Az adatok gyűjtése 96 x 0,625 mm-es kollimációval és 330 ms-os portálforgási idővel történik. 60-90 ml nemionos kontrasztanyag 5 ml/s áramlási sebességgel történő intravénás injekcióját egy 30 ml-es sóoldat bolus követi (3 ml/s). A felvétel a belégzési légzés visszatartása során történik, miközben az elektrokardiogramot egyidejűleg rögzítik, hogy a pulzusszámtól függően lehetővé váljon az adatok retrospektív vagy prospektív kapuzása. Az összes kép 0,67 mm-es szeletvastagsággal és 0,34 mm-es szeletlépéssel lesz rekonstruálva. A teljes adatkészletet egy dedikált CT-munkaállomásra továbbítják egy 3-dimenziós rekonstrukciós eszközzel, amelyet kifejezetten a koszorúér angiográfiához terveztek (Philips Intellispace Portal, 7.0-s verzió), amely lehetővé teszi a többsíkú reformációt és a plakk kvantitatív elemzését. Egy független olvasó áttekinti az összes tanulmányt. Minden jelentős szűkületet tartalmazó eret ívelt, többsíkú újraformázott képeken elemeznek, hosszú tengelyű és keresztmetszeti nézetekben. Mérni kell az átmérőket a maximális szűkület helyén, valamint a proximális és disztális referenciapontokon. A szűkület mértékét a maximális szűkületi átmérő és a proximális és disztális referenciapontok átmérőinek átlaga közötti különbség hányadosaként kell kiszámítani, osztva a proximális és disztális referenciapontok átmérőinek átlagával, és százalékban kifejezve. Az átépülési indexet úgy számítják ki, hogy a maximális szűkület helyén a külső érterületet osztják a proximális és disztális referenciapontoknál lévő külső érterületek átlagával. A pozitív átalakítást ≥ 1,05 átalakítási indexként határozzuk meg. A plakk térfogatát a rendszer automatikusan kiszámítja a luminális és a külső érhatárok között szegmentált összes voxel térfogataként ívelt többsíkú újraformázott képeken. Proximális és disztális referenciákat használunk a plakkok proximális és disztális végeként. A vizsgálók jelenteni fogják a plakk teljes térfogatát és a plakk altípusok térfogatát: meszesedett, nem meszesedett és kevert plakkok.

Szívkatéterezés és percutan coronaria intervenció (PCI). A katéterezési laboratóriumba a betegek klinikai megjelenésüknek megfelelően kerülnek be, figyelembe véve az aktuális ESC/AHA klinikai irányelveket. A szívkatéterezési eljárást szokásos perkután technikák alkalmazásával hajtják végre a radiális vagy femorális artérián keresztül. A szívkoszorúér elváltozásokat a kezelő vizuális becsléssel vagy egyéb objektív mérésekkel, például kvantitatív koszorúér-analízissel (QCA) értékeli a szűkület szempontjából. A koszorúér-beavatkozást, beleértve a ballonos angioplasztikát és a stent beültetést, szükség szerint és a koszorúér-szűkület súlyosságától függően (≥70%-os átmérőjű szűkület) hajtják végre. A kiegészítő koszorúér-képalkotást (OCT vagy intravaszkuláris ultrahang) a kezelő belátása szerint és a vizsgálati protokolltól függetlenül kell elvégezni. Az eljárás során minden beteget véralvadásgátlóval (többnyire nem frakcionált heparinnal) kezelnek, az aktivált véralvadási idő gondos, 250-300 másodperces ellenőrzése mellett. Az angioplasztikai beavatkozást követően minden beteg kettős thrombocyta-aggregáció-ellenes terápiában részesül, amely aszpirint és P2Y12-gátlót (klinikai javallattól függően clopidogrel, prasugrel vagy ticagrelor) kombinál, 6-12 hónapig, kivéve, ha ennek ellenjavallata van, pl. orális antikoagulánsokkal történő kezelés.

Genomi DNS kivonás és szűrés. A székletmintákból származó genomiális DNS-t a Tecan automatizált platformra optimalizált PowerMag Soil DNS izolációs készlettel (MoBio) tisztítják. A sörétes szekvenáláshoz 100 ng tisztított DNS-t vágnak le Covaris E220X szonikátorral.

Mikrobiom elemzés. A mikrobiommintákat egy automata robotcsővel dolgozzák fel 96 lyukú formátumban. Minden összegyűjtött mintacsoportot robotizáltan dolgoznak fel mind a 16S, mind a metagenomikus szekvenáláshoz.

Mikrobióm alapú funkciók generálása. A kutatók egy olyan számítási folyamatot fognak alkalmazni és tovább bővíteni, amelyet arra fejlesztettek ki, hogy egy metagenomikus mintából gazdag tulajdonságkészletet állítsanak elő. Ezek a jellemzők képezik majd a mikrobióm-alapú aláírásokat azonosító modellek alapját.

Baktériumok és vírusok mennyisége – A metagenom minta feltérképezése egy referencia bakteriális genom adatbázishoz, majd az egyes baktériumokra feltérképező leolvasások számának számlálása, ami az egyes mintákhoz tartozó relatív bakteriális abundancia vektorát eredményezi.

Bakteriális diverzitás – A fent leírt relatív bakteriális abundanciák felhasználásával a kutatók számos mérőszámot fognak kiszámítani a baktériumok és vírusok diverzitására vonatkozóan egy metagenom mintában (pl. a relatív abundancia vektor Shannon-entrópiája, a baktériumok száma bizonyos minimális abundanciaszint felett), mivel kimutatták, hogy a minták sokfélesége összefüggésbe hozható a gazdaszervezet bizonyos fiziológiai vonatkozásaival, például az általános zsírossággal és az inzulinrezisztenciával.

Baktériumnövekedési sebességek – A kutatók minden metagenommintához kiszámolnak egy vektort, amely megfelel a mintában lévő egyes baktériumok növekedési sebességének, egy új módszert használva, amelyet nemrégiben fejlesztettek ki erre a célra. Röviden, a szekvenálás olvasási lefedettségének (mélységének) vizsgálatával a különböző baktériumgenomok hosszában a kutatók azt találták, hogy sok baktérium prototipikus lefedettségi mintázatot mutat, amely egyetlen mélyedésből és egyetlen csúcsból áll. Nevezetesen, a csúcs helye egybeesik a baktérium ismert replikációs origóval, ami arra utal, hogy a csúcs közelében lévő hozzáadott leolvasási lefedettség az újonnan replikált DNS-t képviseli. Bármely adott baktérium esetében a csúcs és a mélyedés közötti arány nagymértékben változik a különböző emberi bélmikrobiomokból származó mintákban, a magas arányok hasonlóak a tenyészetben tenyésztett baktériumok exponenciális növekedési fázisában elértekhez, az alacsony arányok pedig a helyhez kötött növekedéshez. fázis.

Génbőség – A kutatók a metagenom mintákban lévő gének relatív abundanciáját a fentihez hasonló megközelítés alkalmazásával számítják ki a baktériumok relatív abundanciájának meghatározására. Ebből a célból ahelyett, hogy a leolvasott adatokat a referencia bakteriális genom adatbázishoz térképeznék fel, a kutatók a bakteriális gének referenciaadatbázisába fogják leképezni őket, amelyet nemrégiben bővítettek ki, és amely együttesen több mint 3 millió különböző bakteriális gént tartalmaz. A származtatott génbőség-vektorok komplementerek a baktériumbőség-vektorokkal, azzal az előnnyel, hogy olyan géneket térképeznek fel, amelyek beágyazó bakteriális genomja ismeretlen, és így több metagenom szekvenálási leolvasást tesz lehetővé, hátránya pedig, hogy sokkal nagyobb jellemzővektort állít elő.

Biológiai útvonalak bősége – A mikrobiota funkcionális szintjén információt nyújtó jellemzők másik csoportjaként a kutatók a biológiai útvonalak KEGG adatbázisát51 és az egyes minták génbőségének fenti vektorát fogják használni az egyes biológiai útvonalak abundancia-pontszámának kiszámításához. Ennek a jellemzőkészletnek a legfontosabb előnye, hogy asszociációi közvetlen hipotéziseket adnak a mögöttes mechanizmusokra vonatkozóan, amelyeken keresztül a mikrobiota részt vehet a korrelált fenotípusban.

Mintatárolás. A mintákat, valamint a megmaradt DNS-t és a fagyasztott szérumokat -80 C-os fagyasztókban tárolják. A feldolgozatlan székletmintákat (például nem minden évente gyűjtött mintát dolgoznak fel kezdetben) szintén -800 C-os fagyasztókban tárolják.

Statisztikai analízis. Klinikai adatok, például életjelek, kardiovaszkuláris rizikófaktorok (életkor, nem, lipidprofil, glikémiás index, dohányzási állapot, korábbi CAD), krónikus társbetegségek, rendszeres kábítószer-használat, szív-CT és/vagy szívkatéterezés képalkotó eredményei, valamint a szívenzimek szintjét a Rabin Medical Centerben gyűjtik össze. A Weizmann Tudományos Intézetben, a Segal Lab számítástechnikai osztályán a kutatók elemzik az adatokat. Minden egyes paraméterhez asszociációs elemzést kell végezni, hogy azonosítsák az összes mikrobiomparamétert, amely ezekhez a klinikai paraméterekhez kapcsolódik.

Azoknál a betegeknél, ahol az ismert probiotikus és/vagy táplálkozási beavatkozások a kívánt változáshoz vezethetnek a mikrobiom aláírások elemzése után, a vizsgálók beavatkoznak, majd a beavatkozást követően a mikrobiom szekvenálásával monitorozzák.