Fungerer det menneskelige tarmmikrobiom som et nyt personligt terapeutisk mål for koronar aterosklerose?

Introduktion:

Det menneskelige mave-tarmsystem er befolket med en række forskellige symbiotiske mikroorganismer, nemlig mikrobiota. Dens samlede vægt er cirka 2 kg og indeholder billioner af mikroorganismer. Mikrobiomet er de samlede genetiske (metagenomiske) data for mikrobiotaen. I de senere år har udviklingen af ​​effektive metoder til genomsekventering og bioinformatik muliggjort hurtig og nøjagtig kvantificering og kvalificering af mikrobiomet, hvilket har gjort mikrobiomanalyse til den førende metode til mikrobiotaforskning.

Koronararteriesygdom (CAD) tegnede sig for mere end 8 millioner dødsfald årligt på verdensplan. Især er akut koronarsyndrom (ACS) fortsat en væsentlig årsag til morbiditet og dødelighed og er ansvarlig for mere end 1 million hospitalsindlæggelser i USA årligt. Det patofysiologiske kendetegn ved ACS er koronar trombose forårsaget af aterosklerotisk plaqueskade, hvor to typer skader beskrives. Den første er plaksprængning, som fortsat er den mest almindelige årsag til koronar aterotrombose, og den anden er overfladisk plakerosion, som genkendes med stigende hyppighed. I modsætning til plaquesprængning har læsioner, der er forårsaget af erosion, ikke tynde fibrøse hætter, rigelige inflammatoriske celler eller en stor lipidkerne, men snarere rige på ekstracellulær matrix, såsom proteoglycaner og glycosaminoglycaner.

Billeddiagnostiske undersøgelser såsom koronar computertomografisk angiografi (CCTA) og diagnostiske koronarkateteriseringer med eller uden optisk kohærenstomografi (OCT) bruges i stigende grad i klinisk praksis for at karakterisere den mekanisme, der er ansvarlig for ustabil/sårbar aterosklerotisk plak.

Den menneskelige tarmmikrobiota interagerer i udstrakt grad med værten gennem metabolisk udveksling og co-metabolisme af substrater; derved bidrage til en række forskellige metaboliske og immunologiske mekanismer i den menneskelige krop. CAD er et stort interessefelt inden for mikrobiotaforskning, og der har været flere fund, der forbinder tarmmikrobiotaen med CAD-patofysiologi. For det første var mikrobiota forbundet med metabolisk syndrom, nemlig fedme og insulinresistens. Det er en hypotese, at tarmmikrobiota kan øge kortkædede fedtsyrer, som i sidste ende øger appetitten og dermed forårsager fedme. En anden hypotese er, at tarmmikrobiota-endotoksiner kan translokere til blodbanen, fremkalde inflammatorisk kaskade, der i sidste ende fremmer åreforkalkning. For det andet kan mikrobiota også have en rolle i udviklingen af ​​åreforkalkning. Hos patienter med symptomatisk åreforkalkning er der et unikt mikrobiommønster, som kan have pro-inflammatoriske egenskaber. For nylig blev der fundet et unikt mikrobielt mønster blandt patienter med høj kardiovaskulær risikoprofil. For det tredje metaboliserer tarmmikrobiota diætphosphatidylcholin (lecitin) for at producere metabolitten trimethylamin-N-oxid (TMAO), som er forbundet med øget risiko for kardiovaskulære hændelser.

De hidtil offentliggjorte data vedrører udelukkende interaktionen mellem menneskets tarmmikrobiom og kardiovaskulære risikofaktorer. Så vidt efterforskerens viden og forståelse mangler, mangler mikrobiomanalysen af ​​patienter med en etableret diagnose CAD (inklusive ACS).

Mål:

Formålet med det aktuelle studie er at undersøge tarmmikrobiotaen hos patienter med symptomatisk CAD, både i stabile og i akutte faser. Forskerne antager, at studiedeltagerne vil præsentere med en unik mikrobiomsignatur, der kan give et nyt indblik i patofysiologien af ​​aterosklerotisk CAD, samtidig med at det giver formodede terapeutiske implikationer.

Efter at have etableret den unikke mikrobiom-signatur i en stor kohorte af CAD-patienter, ville efterforskerne korrelere den til TMAO-niveauer for yderligere at undersøge dens del i patofysiologien af ​​CAD. I den sidste fase ville efterforskerne forsøge at finde måder at justere personlige behandlingsmuligheder for at ændre den "pro-aterosklerotiske" tarmmikrobiota. Ved at bruge data fra det aktuelle studie med efterforskernes tidligere 1000 patientkohorte med kendt mikrobiom og ernæringsprofil, ville den være i stand til at søge efter et specifikt mål for ernæringsintervention, såsom probiotika. Derefter ville efterforskerne overvåge patienterne med sekventering af mikrobiomet efter den ernæringsmæssige intervention.

Metoder:

Studiedesign og rekruttering. Deltagerne i undersøgelsen vil være patienter i alderen 30-80, der ankommer til Rabin Medical Center med mistanke om CAD og er i stand til at give informeret samtykke. Deltagerne vil levere medicinske, livsstils- og ernæringsmæssige spørgeskemaer. Blodtryks- og pulsmålinger vil blive taget under indlæggelse samt blodprøver og afføringsprøver og/eller endetarmsprøver. For at vurdere og/eller behandle formodet aterosklerotisk sygdom vil deltagerne gennemgå hjerte-CT og/eller hjertekateterisering i overensstemmelse med plejestandarden og baseret på den behandlende kardiologs beslutning. Diagnostik og behandlingsmuligheder vil kun være baseret på deltagernes medicinske tilstand og uanset den førnævnte undersøgelsesprotokol.

Kontrolgruppen vil blive udvalgt til at repræsentere en gruppe, der matcher alder, køn og kardiovaskulære risikofaktorer uden aktuel CAD. Yderligere eksklusionskriterier i kontrolgruppen vil være antibiotikaforbrug i de følgende 3 måneder, inflammatorisk tarmsygdom eller anden signifikant kronisk sygdom, som kan påvirke mikrobiotaen (såsom cancer, autoimmun sygdom og kronisk immunsuppressiv behandling). Kontrolgruppen vil gennemgå hjerte-CT eller koronar angiografi i henhold til klinisk mistanke for at udelukke CAD og uafhængigt af undersøgelsesprotokollen.

Blodprøver. 10 ml veneblod vil blive opsamlet i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og gel med koagelaktivator-holdige rør fra de indskrevne patienter i alle undersøgelsesdeltagere. Koncentrationerne af serumkreatinin, troponin, kreatinfosphokinase (CPK), hæmoglobin, triglycerider (TG), total kolesterol (TC), high-density lipoproteiner (HDL), low-density lipoproteiner (LDL), glucose, c-reaktivt protein ( CRP), b-type natriuretisk peptid (BNP) og hæmoglobin A1c (HbA1C) vil blive målt med automatisk biokemisk analysator.

Derudover vil niveauerne af TMAO blive målt fra blodplasma ved brug af Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) som tidligere beskrevet.

Ernæringsprofilering. Alle deltagere vil rapportere deres vaner med madforbrug ved at udfylde Food Frequency Questionnaire (FFQ).

Hjerte-CT-analyse. Udvalgte deltagere vil gennemgå CT-angiografi til evaluering og kvantificering af CAD ved hjælp af et 256-slice system (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Data vil blive indsamlet med en kollimering på 96 X 0,625 mm og en portalrotationstid på 330 ms. Intravenøs injektion af 60 til 90 ml nonionisk kontrastmiddel med en flowhastighed på 5 ml/s vil blive efterfulgt af en 30 ml saltvands-chase-bolus (3 ml/s). Optagelsen vil blive udført under en inspiratorisk vejrtrækning, mens elektrokardiogrammet vil blive optaget samtidigt for at tillade, afhængigt af hjertefrekvensen, retrospektiv eller prospektiv gating af dataene. Alle billeder vil blive rekonstrueret med en skivetykkelse på 0,67 mm og en skivestigning på 0,34 mm. Det komplette datasæt vil blive transmitteret til en dedikeret CT-arbejdsstation med et 3-dimensionelt rekonstruktionsværktøj, der er specielt designet til koronar angiografi (Philips Intellispace Portal, version 7.0) for at muliggøre multiplanare reformationer og kvantitativ plakanalyse. En uafhængig læser vil gennemgå alle undersøgelser. Hvert kar, der indeholder signifikant stenose, vil blive analyseret i buede multiplanar omformaterede billeder i langakse og tværsnitsvisninger. Diametre på stedet for maksimal stenose og ved proksimale og distale referencer vil blive målt. Grad af stenose vil blive beregnet som forholdet mellem forskellen mellem diameteren ved maksimal stenose og middelværdien af ​​diametre ved de proksimale og distale referencer divideret med middelværdien af ​​diametre ved proksimale og distale referencer og udtrykt i procent. Remodelleringsindeks vil blive beregnet som det ydre karareal på stedet for maksimal stenose divideret med gennemsnittet af ydre kararealer ved proksimale og distale referencer. Positiv ombygning vil blive defineret som et ombygningsindeks ≥ 1,05. Plaquevolumen vil automatisk blive beregnet som volumenet af alle voxels segmenteret mellem de luminale og ydre kargrænser på buede, omformaterede multiplanar-billeder. Proksimale og distale referencer vil blive brugt som de proksimale og distale ender af plaques. Efterforskerne vil rapportere det samlede volumen af ​​plak og volumen af ​​plaque-undertyper: forkalkede, ikke-forkalkede og blandede plaques.

Hjertekateterisering og perkutan koronar intervention (PCI). Patienter vil blive indlagt i kateteriseringslaboratoriet i henhold til deres kliniske præsentation under hensyntagen til de nuværende ESC/AHA kliniske retningslinjer. Hjertekateteriseringsproceduren vil blive udført ved brug af standard perkutane teknikker via den radiale eller femorale arterie. Koronare læsioner vil blive evalueret af operatøren med hensyn til stenose ved visuel estimering eller andet ved brug af objektive målinger, såsom kvantitativ koronaranalyse (QCA). Koronar intervention, herunder ballonangioplastik og stentimplantation, vil blive implementeret efter behov og i henhold til sværhedsgraden af ​​koronar stenose, dvs. (≥70 % diameter stenose). Adjuvant koronar billeddannelse (OCT eller intravaskulær ultralyd) vil blive udført i henhold til operatørens skøn og uanset undersøgelsesprotokollen. Alle patienter vil blive behandlet under proceduren med antikoagulering (for det meste ufraktioneret heparin) ved hjælp af omhyggelig overvågning af aktiveret koagulationstid mellem 250-300 sekunder. Efter angioplastikproceduren vil alle patienter blive behandlet med dobbelt anti-trombocytbehandling, der kombinerer aspirin og P2Y12-hæmmer (clopidogrel, prasugrel eller ticagrelor, alt efter den kliniske indikation) i 6-12 måneder, medmindre der vil være kontraindikation, som f.eks. behandling med orale antikoagulantia.

Genomisk DNA-ekstraktion og filtrering. Genomisk DNA fra afføringsprøver vil blive oprenset ved hjælp af PowerMag Soil DNA isolation kit (MoBio) optimeret til Tecan automatiseret platform. Til haglgeværsekventering vil 100 ng oprenset DNA blive skåret med en Covaris E220X sonikator.

Mikrobiom analyse. Mikrobiomprøver vil blive behandlet af en automatiseret robotrørledning i 96-brønds format. Hver prøvegruppe indsamlet vil blive behandlet robotisk til både 16S og metagenomisk sekventering.

Generering af mikrobiom-baserede funktioner. Efterforskerne vil anvende og yderligere udvide en beregningspipeline, der blev udviklet til at generere et rigt sæt funktioner fra en metagenomisk prøve. Disse funktioner vil være grundlaget for modeller, der identificerer mikrobiom-baserede signaturer.

Bakterie- og viralforekomster - Kortlægning af metagenomprøven til en referencebakteriegenomdatabase og tæl derefter antallet af læsninger, der kortlægges til hver bakterie, hvilket resulterer i en vektor af relative bakteriemængder for hver prøve.

Bakteriel diversitet - Ved at bruge de relative bakterielle mængder afledt ovenfor, vil efterforskerne beregne flere mål for mangfoldigheden af ​​bakterier og vira i en metagenomprøve (f. prøvediversitet viste sig at være forbundet med visse fysiologiske aspekter af værten, såsom overordnet fedt og insulinresistens.

Bakterievæksthastigheder - For hver metagenomprøve vil efterforskerne beregne en vektor, der svarer til væksthastigheden af ​​hver bakterie i prøven, ved hjælp af en ny metode, der for nylig blev udviklet til dette formål. Kort fortalt, ved at undersøge mønsteret for sekventering af læst dækning (dybde) på tværs af længden af ​​forskellige bakterielle genomer, fandt forskerne, at mange bakterier udviser et prototypisk dækningsmønster, der består af et enkelt lavpunkt og en enkelt top. Navnlig falder toppens placering sammen med bakteriernes kendte replikationsorigin, hvilket tyder på, at den tilføjede læsedækning nær toppen repræsenterer nyligt replikeret DNA. For en given bakterie varierer forholdet mellem top- og bunddækningen meget på tværs af prøver fra forskellige humane tarmmikrobiomer, hvor høje forhold svarer til dem, der opnås under eksponentiel vækstfase for bakterier dyrket i kultur, og lave forhold svarer til vækst i stationære bakterier. fase.

Genforekomster - Forskerne vil beregne den relative forekomst af gener i metagenomprøver ved at anvende en lignende tilgang til den ovenfor for at udlede relative mængder af bakterier. Til dette formål, i stedet for at kortlægge aflæsningerne til referencedatabasen for bakterielle genomer, vil efterforskerne kortlægge dem til en referencedatabase over bakterielle gener, som for nylig blev udvidet, og som tilsammen indeholder over 3 millioner forskellige bakterielle gener. De afledte genoverflodsvektorer er komplementære til bakterieoverflodsvektorerne, med fordelen at kortlægges til gener, hvis indlejrende bakteriegenom er ukendt, og dermed tillader flere metagenom-sekventeringslæsninger at blive kortlagt, og med den ulempe, at de producerer en meget større funktionsvektor.

Biologiske pathway-overflod - Som et andet sæt funktioner, der giver information på det funktionelle niveau af mikrobiotaen, vil efterforskerne bruge KEGG-databasen over biologiske pathways51 og ovenstående vektor af genoverflod af hver prøve til at beregne en abundance-score for hver biologisk pathway. Den vigtigste fordel ved dette sæt funktioner er, at dets associationer giver direkte hypoteser vedrørende de underliggende mekanismer, hvorigennem mikrobiotaen kan være involveret i den korrelerede fænotype.

Opbevaring af prøver. Prøverne samt resterende DNA og frosne serum vil blive opbevaret i -80C frysere. Ubehandlede afføringsprøver (f.eks. vil ikke alle prøver, der indsamles årligt, blive behandlet i starten) vil også blive opbevaret i -800C frysere.

Statistisk analyse. Kliniske data såsom vitale tegn, kardiovaskulære risikofaktorer (alder, køn, lipidprofil, glykæmisk indeks, rygestatus, tidligere CAD), kroniske komorbiditeter, regelmæssig medicinbrug, billeddiagnostiske fund på hjerte-CT og/eller hjertekateterisering samt Hjerteenzymer niveauer vil blive indsamlet på Rabin Medical Center. På Weizmann Institute of Science, i datalogiafdelingen ved Segal Lab, vil efterforskerne analysere dataene. For hver parameter vil der blive udført en associationsanalyse for at identificere alle de mikrobiomparametre, der er forbundet med disse kliniske parametre.

Efter at have analyseret mikrobiomets signaturer hos de patienter, hvor kendte probiotiske og/eller ernæringsmæssige indgreb kan føre til den ønskede ændring, vil efterforskerne gribe ind og derefter monitorere med sekventering af mikrobiomet efter interventionen.