O microbioma intestinal humano serve como um novo alvo terapêutico personalizado para a aterosclerose coronária?

Introdução:

O sistema gastrointestinal humano é povoado por uma variedade de microrganismos simbióticos, nomeadamente a microbiota. Seu peso total é de aproximadamente 2 quilos, contendo trilhões de microrganismos. O microbioma é o total de dados genéticos (metagenômicos) da microbiota. Nos últimos anos, o desenvolvimento de métodos eficientes para sequenciamento do genoma e bioinformática permitiu a quantificação e qualificação rápida e precisa do microbioma, tornando a análise do microbioma o principal método de pesquisa da microbiota.

A doença arterial coronariana (DAC) é responsável por mais de 8 milhões de mortes anualmente em todo o mundo. Em particular, a síndrome coronariana aguda (SCA) continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade e é responsável por mais de 1 milhão de internações hospitalares nos Estados Unidos anualmente. A marca fisiopatológica da SCA é a trombose coronária causada por lesão da placa aterosclerótica, sendo descritos dois tipos de lesões. A primeira é a ruptura da placa, que continua a ser a causa mais comum de aterotrombose coronária, e a segunda é a erosão da placa superficial que é reconhecida com frequência crescente. Ao contrário da ruptura da placa, as lesões causadas por erosão não apresentam capas fibrosas finas, células inflamatórias abundantes ou um grande núcleo lipídico, mas sim ricas em matriz extracelular, como proteoglicanos e glicosaminoglicanos.

Estudos de imagem, como a angiotomografia computadorizada de coronárias (TACC) e cateterismos coronários diagnósticos com ou sem tomografia de coerência óptica (OCT), estão sendo cada vez mais utilizados na prática clínica para caracterizar o mecanismo responsável pela placa aterosclerótica instável/vulnerável.

A microbiota intestinal humana interage extensivamente com o hospedeiro por meio de troca metabólica e co-metabolismo de substratos; contribuem assim para uma variedade de mecanismos metabólicos e imunológicos no corpo humano. A CAD é um grande campo de interesse na pesquisa da microbiota, e houve várias descobertas que conectam a microbiota intestinal à fisiopatologia da CAD. Primeiro, a microbiota foi associada à síndrome metabólica, ou seja, obesidade e resistência à insulina. Supõe-se que a microbiota intestinal pode aumentar os ácidos graxos de cadeia curta, que eventualmente aumentam o apetite, causando obesidade. Outra hipótese é que as endotoxinas da microbiota intestinal podem se translocar para a corrente sanguínea, provocando uma cascata inflamatória que eventualmente promove a aterosclerose. Em segundo lugar, a microbiota também pode ter um papel no desenvolvimento da aterosclerose. Em pacientes com aterosclerose sintomática, existe um padrão de microbioma único que pode ter características pró-inflamatórias. Recentemente, um padrão microbiano único foi encontrado entre pacientes com perfil de alto risco cardiovascular. Terceiro, a microbiota intestinal metaboliza a fosfatidilcolina dietética (lecitina) para produzir o metabólito trimetilamina-N-óxido (TMAO), que está associado ao aumento do risco de eventos cardiovasculares.

Os dados publicados até agora referem-se apenas à interação entre o microbioma intestinal humano e os fatores de risco cardiovascular. De acordo com o melhor conhecimento e compreensão do investigador, falta a análise do microbioma de pacientes com diagnóstico estabelecido de DAC (incluindo SCA).

Objetivos.

O objetivo do presente estudo é investigar a microbiota intestinal de pacientes com DAC sintomática, tanto na fase estável quanto na fase aguda. Os investigadores levantam a hipótese de que os participantes do estudo apresentariam uma assinatura única de microbioma que pode fornecer uma nova visão sobre a fisiopatologia da DAC aterosclerótica, ao mesmo tempo em que oferece implicações terapêuticas putativas.

Depois de estabelecer a assinatura única do microbioma em uma grande coorte de pacientes com DAC, os investigadores poderiam correlacioná-la aos níveis de TMAO para investigar melhor sua parte na fisiopatologia da DAC. No estágio final, os pesquisadores tentariam encontrar maneiras de ajustar as opções de tratamento personalizado para alterar a microbiota intestinal "pró-aterosclerótica". Ao usar os dados do estudo atual com a coorte anterior de 1.000 pacientes dos investigadores com microbioma e perfil nutricional conhecidos, seria possível procurar um alvo específico para intervenção nutricional, como probióticos. Em seguida, os pesquisadores monitorariam os pacientes com o sequenciamento do microbioma após a intervenção nutricional.

Métodos:

Desenho do estudo e recrutamento. Os participantes do estudo serão pacientes com idade entre 30 e 80 anos que chegam ao Rabin Medical Center com suspeita de DAC e capazes de fornecer consentimento informado. Os participantes fornecerão questionários médicos, de estilo de vida e nutricionais. Medições de pressão arterial e frequência cardíaca serão feitas durante a hospitalização, bem como exames de sangue e amostras fecais e/ou swabs retais. Para avaliar e/ou tratar a suspeita de doença aterosclerótica, os participantes serão submetidos a TC cardíaca e/ou cateterismo cardíaco de acordo com o padrão de atendimento e com base na decisão do cardiologista responsável. As opções de diagnóstico e tratamento serão baseadas apenas na condição médica dos participantes e independentemente do protocolo de estudo mencionado acima.

O grupo controle será selecionado para representar um grupo pareado por idade, sexo e fatores de risco cardiovascular sem DAC atual. Outros critérios de exclusão no grupo de controle serão consumo de antibióticos nos 3 meses seguintes, doença inflamatória intestinal ou outra doença crônica significativa que possa influenciar a microbiota (como câncer, doença autoimune e tratamento imunossupressor crônico). O grupo controle será submetido a TC cardíaca ou angiografia coronária de acordo com a suspeita clínica para descartar DAC e independentemente do protocolo do estudo.

Amostras de sangue. Serão coletados 10 ml de sangue venoso em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e gel com ativador de coágulo - contendo tubos dos pacientes inscritos em todos os participantes do estudo. As concentrações de creatinina sérica, troponina, creatina fosfoquinase (CPK), hemoglobina, triglicerídeos (TG), colesterol total (TC), lipoproteínas de alta densidade (HDL), lipoproteínas de baixa densidade (LDL), glicose, proteína c-reativa ( PCR), peptídeo natriurético tipo b (BNP) e hemoglobina A1c (HbA1C) serão dosados ​​por analisador bioquímico automático.

Além disso, os níveis de TMAO serão medidos a partir do plasma sanguíneo usando Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência - Espectrometria de Massa - Monitoramento de Múltiplas Reações (UHPLC-MS/MRM) conforme descrito anteriormente.

Perfil nutricional. Todos os participantes relatarão seus hábitos de consumo alimentar por meio do preenchimento do Questionário de Frequência Alimentar (QFA).

Análise de TC cardíaca. Os participantes selecionados serão submetidos à angiotomografia para avaliação e quantificação de DAC usando um sistema de 256 cortes (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Os dados serão adquiridos com uma colimação de 96 X 0,625 mm e um tempo de rotação do gantry de 330 ms. A injeção intravenosa de 60 a 90 ml de contraste não iônico a um fluxo de 5 ml/s será seguida de um bolus de 30 ml de solução salina (3 ml/s). A aquisição será realizada durante uma pausa inspiratória enquanto o eletrocardiograma será registrado simultaneamente para permitir, dependendo da frequência cardíaca, o controle retrospectivo ou prospectivo dos dados. Todas as imagens serão reconstruídas com espessura de corte de 0,67 mm e incremento de corte de 0,34 mm. O conjunto de dados completo será transmitido para uma estação de trabalho de TC dedicada com uma ferramenta de reconstrução tridimensional projetada especificamente para angiografia coronária (Philips Intellispace Portal, versão 7.0) para permitir reformações multiplanares e análise quantitativa de placas. Um leitor independente revisará todos os estudos. Cada vaso contendo estenose significativa será analisado em imagens reformatadas multiplanares curvas em eixo longo e cortes transversais. Os diâmetros no local de estenose máxima e nas referências proximal e distal serão medidos. O grau de estenose será calculado como a razão entre a diferença entre o diâmetro na estenose máxima e a média dos diâmetros nas referências proximal e distal dividido pela média dos diâmetros nas referências proximal e distal e expresso em porcentagem. O índice de remodelação será calculado como a área externa do vaso no local de estenose máxima dividida pela média das áreas externas do vaso nas referências proximal e distal. Remodelação positiva será definida como índice de remodelação ≥ 1,05. O volume da placa será calculado automaticamente como o volume de todos os voxels segmentados entre os limites luminal e externo do vaso em imagens reformatadas multiplanares curvas. Referências proximais e distais serão usadas como extremidades proximais e distais das placas. Os investigadores relatarão o volume total da placa e os volumes dos subtipos de placa: placas calcificadas, não calcificadas e mistas.

Cateterismo cardíaco e intervenção coronária percutânea (ICP). Os pacientes serão admitidos no laboratório de cateterismo de acordo com sua apresentação clínica, levando em consideração as diretrizes clínicas atuais da ESC/AHA. O procedimento de cateterismo cardíaco será realizado usando técnicas percutâneas padrão através da artéria radial ou femoral. As lesões coronárias serão avaliadas pelo operador em termos de estenose por estimativa visual ou outras medidas objetivas, como análise coronária quantitativa (QCA). A intervenção coronária, incluindo angioplastia com balão e implantação de stent, será implementada conforme necessário e de acordo com a gravidade da estenose coronária, ou seja, (≥70% de diâmetro da estenose). Imagens coronárias adjuvantes (OCT ou ultrassom intravascular) serão realizadas de acordo com o critério do operador e independentemente do protocolo do estudo. Todos os pacientes serão tratados durante o procedimento com anticoagulação (principalmente heparina não fracionada) com monitoramento cuidadoso do tempo de coagulação ativada entre 250-300 segundos. Após o procedimento de angioplastia, todos os pacientes serão tratados com terapia antiplaquetária dupla combinando aspirina e inibidor P2Y12 (clopidogrel, prasugrel ou ticagrelor, conforme indicação clínica) por 6 a 12 meses, a menos que haja contraindicação, como tratamento com anticoagulantes orais.

Extração e filtragem de DNA genômico. O DNA genômico das amostras de fezes será purificado usando o kit de isolamento PowerMag Soil DNA (MoBio) otimizado para a plataforma automatizada Tecan. Para sequenciamento shotgun, 100 ng de DNA purificado serão cortados com um sonicador Covaris E220X.

Análise de microbioma. As amostras de microbioma serão processadas por um pipeline robótico automatizado em formato de 96 poços. Cada grupo de amostra coletado será processado roboticamente para 16S e sequenciamento metagenômico.

Gerando recursos baseados em microbioma. Os investigadores irão empregar e estender ainda mais um pipeline computacional que foi desenvolvido para gerar um rico conjunto de características de uma amostra metagenômica. Esses recursos serão a base para modelos que identificam assinaturas baseadas em microbiomas.

Abundâncias bacterianas e virais - mapear a amostra de metagenoma para um banco de dados de genoma bacteriano de referência e, em seguida, contar o número de leituras mapeadas para cada bactéria, resultando em um vetor de abundâncias bacterianas relativas para cada amostra.

Diversidade bacteriana - Usando as abundâncias bacterianas relativas derivadas acima, os investigadores calcularão várias medidas da diversidade de bactérias e vírus em uma amostra de metagenoma (por exemplo, entropia de Shannon do vetor de abundância relativa, número de bactérias acima de algum nível mínimo de abundância), como a diversidade da amostra mostrou estar associada a certos aspectos fisiológicos do hospedeiro, como adiposidade geral e resistência à insulina.

Taxas de crescimento bacteriano - Para cada amostra de metagenoma, os investigadores irão calcular um vetor que corresponde à taxa de crescimento de cada bactéria na amostra, usando um método inovador que foi recentemente desenvolvido para esse fim. Resumidamente, ao examinar o padrão de cobertura de leitura de sequenciamento (profundidade) ao longo do comprimento de diferentes genomas bacterianos, os pesquisadores descobriram que muitas bactérias exibem um padrão de cobertura prototípico, consistindo em uma única calha e um único pico. Notavelmente, a localização do pico coincide com a origem de replicação conhecida da bactéria, sugerindo que a cobertura de leitura adicionada perto do pico representa DNA replicado recentemente. Para qualquer bactéria, a proporção entre a cobertura de pico e vale varia muito entre amostras de diferentes microbiomas intestinais humanos, com altas taxas sendo semelhantes às obtidas durante a fase de crescimento exponencial de bactérias cultivadas em cultura e baixas taxas sendo semelhantes ao crescimento em estacionário Estágio.

Abundâncias de genes - Os investigadores calcularão as abundâncias relativas de genes em amostras de metagenoma aplicando uma abordagem semelhante àquela acima para derivar as abundâncias relativas de bactérias. Para esse fim, em vez de mapear as leituras para o banco de dados de genoma bacteriano de referência, os investigadores os mapearão para um banco de dados de referência de genes bacterianos que foi recentemente estendido e que, coletivamente, contém mais de 3 milhões de genes bacterianos distintos. Os vetores de abundância de genes derivados são complementares aos vetores de abundância de bactérias, com a vantagem de mapear genes cujo genoma bacteriano incorporado é desconhecido e, assim, permitir que mais leituras de sequenciamento de metagenoma sejam mapeadas e com a desvantagem de produzir um vetor de características muito maior.

Abundâncias de vias biológicas - Como outro conjunto de recursos que fornecem informações no nível funcional da microbiota, os investigadores usarão o banco de dados KEGG de vias biológicas51 e o vetor acima de abundância de genes de cada amostra para calcular uma pontuação de abundância para cada via biológica. A principal vantagem desse conjunto de características é que suas associações fornecem hipóteses diretas sobre os mecanismos subjacentes pelos quais a microbiota pode estar envolvida com o fenótipo correlacionado.

Armazenamento de amostras. As amostras, bem como o DNA restante e os soros congelados, serão armazenados em freezers a -80C. Amostras de fezes não processadas (por exemplo, nem todas as amostras coletadas anualmente serão processadas inicialmente) também serão armazenadas em freezers de -800C.

Análise estatística. Dados clínicos, como sinais vitais, fatores de risco cardiovascular (idade, sexo, perfil lipídico, índice glicêmico, tabagismo, DAC prévia), comorbidades crônicas, uso regular de drogas, achados de imagem em TC cardíaca e/ou cateterismo cardíaco, bem como os níveis de enzimas cardíacas serão coletados no Rabin Medical Center. No Weizmann Institute of Science, no departamento de ciência da computação do Segal Lab, os pesquisadores vão analisar os dados. Para cada parâmetro, uma análise de associação será realizada para identificar todos os parâmetros do microbioma associados a esses parâmetros clínicos.

Depois de analisar as assinaturas do microbioma nesses pacientes, onde as intervenções probióticas e/ou nutricionais conhecidas podem levar à mudança desejada, os investigadores intervirão e monitorarão o sequenciamento do microbioma após a intervenção.