Fungerer det menneskelige tarmmikrobiomet som et nytt personlig terapeutisk mål for koronar aterosklerose?

Introduksjon:

Det menneskelige gastrointestinale systemet er befolket med en rekke symbiotiske mikroorganismer, nemlig mikrobiota. Dens totale vekt er omtrent 2 kg, og inneholder billioner av mikroorganismer. Mikrobiomet er de totale genetiske (metagenomiske) dataene til mikrobiotaen. De siste årene har utviklingen av effektive metoder for genomsekvensering og bioinformatikk muliggjort rask og nøyaktig kvantifisering og kvalifisering av mikrobiomet, noe som har gjort mikrobiomanalyse til ledende metode for mikrobiotaforskning.

Koronararteriesykdom (CAD) sto for mer enn 8 millioner dødsfall årlig på verdensbasis. Spesielt er akutt koronarsyndrom (ACS) fortsatt en viktig årsak til sykelighet og dødelighet og er ansvarlig for mer enn 1 million sykehusinnleggelser i USA årlig. Det patofysiologiske kjennetegnet ved ACS er koronar trombose forårsaket av aterosklerotisk plakkskade, med to typer skader som beskrives. Den første er plakkruptur, som fortsatt er den vanligste årsaken til koronar atero-trombose, og den andre er overfladisk plakkerosjon som gjenkjennes med økende frekvens. I motsetning til plakkruptur, har ikke lesjoner som er forårsaket av erosjon tynne fibrøse hetter, rikelig med inflammatoriske celler eller en stor lipidkjerne, men heller rik på ekstracellulær matrise, som proteoglykaner og glykosaminoglykaner.

Bildestudier som koronar computertomografisk angiografi (CCTA) og diagnostiske koronarkateteriseringer med eller uten optisk koherenstomografi (OCT) brukes i økende grad i klinisk praksis for å karakterisere mekanismen som er ansvarlig for ustabil/sårbar aterosklerotisk plakk.

Den menneskelige tarmmikrobiotaen interagerer i utstrakt grad med verten gjennom metabolsk utveksling og samtidig metabolisme av substrater; derved bidra til en rekke metabolske og immunologiske mekanismer i menneskekroppen. CAD er et stort interessefelt innen mikrobiotaforskning, og det har vært flere funn som kobler tarmmikrobiotaen til CAD-patofysiologi. For det første var mikrobiota assosiert med metabolsk syndrom, nemlig fedme og insulinresistens. Det er antatt at tarmmikrobiota kan øke kortkjedede fettsyrer, som til slutt øker appetitten, og dermed forårsaker fedme. En annen hypotese er at endotoksiner fra tarmmikrobiota kan translokere inn i blodet, fremkalle inflammatorisk kaskade som til slutt fremmer aterosklerose. For det andre kan mikrobiota også ha en rolle i utviklingen av aterosklerose. Hos pasienter med symptomatisk aterosklerose er det et unikt mikrobiommønster som kan ha pro-inflammatoriske egenskaper. Nylig ble det funnet et unikt mikrobielt mønster blant pasienter med høy kardiovaskulær risikoprofil. For det tredje metaboliserer tarmmikrobiota fosfatidylkolin (lecitin) i kosten for å produsere metabolitten trimetylamin-N-oksid (TMAO), som er assosiert med økt risiko for kardiovaskulære hendelser.

Dataene publisert så langt er utelukkende knyttet til interaksjonen mellom menneskelig tarmmikrobiom og kardiovaskulære risikofaktorer. Så vidt etterforskeren vet og forstår mangler mikrobiomanalysen av pasienter med en etablert diagnose CAD (inkludert ACS).

Mål:

Formålet med denne studien er å undersøke tarmmikrobiotaen til pasienter med symptomatisk CAD, både i stabile og i akutte faser. Etterforskerne antar at studiedeltakerne vil presentere en unik mikrobiomsignatur som kan gi en ny innsikt i patofysiologien til aterosklerotisk CAD, samtidig som de gir antatte terapeutiske implikasjoner.

Etter å ha etablert den unike mikrobiomsignaturen i en stor gruppe CAD-pasienter, ville etterforskerne korrelere den til TMAO-nivåer for å undersøke dens del i patofysiologien til CAD ytterligere. I den siste fasen ville etterforskerne prøve å finne måter å justere personlige behandlingsalternativer for å endre den "pro-aterosklerotiske" tarmmikrobiotaen. Ved å bruke data fra den nåværende studien med etterforskernes tidligere 1000 pasientkohort med kjent mikrobiom og ernæringsprofil, ville den kunne søke etter et spesifikt mål for ernæringsintervensjon, for eksempel probiotika. Deretter ville etterforskerne overvåke pasientene med sekvensering av mikrobiomet etter ernæringsintervensjonen.

Metoder:

Studiedesign og rekruttering. Studiedeltakere vil være pasienter i alderen 30-80 år som kommer til Rabin Medical Center med mistanke om CAD og kan gi informert samtykke. Deltakerne vil gi medisinske, livsstils- og ernæringsspørreskjemaer. Blodtrykks- og hjertefrekvensmålinger vil bli tatt under sykehusinnleggelse samt blodprøver og avføringsprøver og/eller endetarmsprøver. For å evaluere og/eller behandle mistenkt aterosklerotisk sykdom vil deltakerne gjennomgå hjerte-CT og/eller hjertekateterisering i samsvar med standarden for omsorg og basert på avgjørelsen fra den behandlende kardiologen. Diagnostikk og behandlingsalternativer vil kun være basert på deltakernes medisinske tilstand og uavhengig av den nevnte studieprotokollen.

Kontrollgruppen vil bli valgt til å representere en alder, kjønn og kardiovaskulære risikofaktorer-matchet gruppe uten nåværende CAD. Ytterligere eksklusjonskriterier i kontrollgruppen vil være antibiotikaforbruk de neste 3 månedene, inflammatorisk tarmsykdom eller annen betydelig kronisk sykdom som kan påvirke mikrobiotaen (som kreft, autoimmun sykdom og kronisk immunsuppressiv behandling). Kontrollgruppen vil gjennomgå hjerte-CT eller koronar angiografi i henhold til klinisk mistanke for å utelukke CAD og uavhengig av studieprotokollen.

Blodprøver. 10 ml veneblod vil bli samlet inn i Ethylenediamintetraeddiksyre (EDTA) og gel med rør som inneholder koagelaktivator fra de registrerte pasientene i alle studiedeltakerne. Konsentrasjonene av serumkreatinin, troponin, kreatinfosfokinase (CPK), hemoglobin, triglyserider (TG), totalkolesterol (TC), lipoproteiner med høy tetthet (HDL), lipoproteiner med lav tetthet (LDL), glukose, c-reaktivt protein ( CRP), b-type natriuretisk peptid (BNP) og hemoglobin A1c (HbA1C) vil bli målt med automatisk biokjemianalysator.

I tillegg vil nivåene av TMAO bli målt fra blodplasma ved bruk av Ultra-High Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometric - Multiple Reaction Monitoring (UHPLC-MS/MRM) som tidligere beskrevet.

Ernæringsmessig profilering. Alle deltakere vil rapportere sine vaner med matforbruk ved å fylle ut Food Frequency Questionnaire (FFQ).

Hjerte-CT-analyse. Utvalgte deltakere vil gjennomgå CT-angiografi for evaluering og kvantifisering av CAD ved bruk av et 256-slice-system (Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio). Data vil bli innhentet med en kollimering på 96 X 0,625 mm og en portalrotasjonstid på 330 ms. Intravenøs injeksjon av 60 til 90 ml ikke-ionisk kontrastmiddel med en strømningshastighet på 5 ml/s vil bli etterfulgt av en 30 ml saltvannsjaktbolus (3 ml/s). Innsamling vil bli utført under et inspiratorisk pusthold mens elektrokardiogrammet vil bli registrert samtidig for å tillate, avhengig av hjertefrekvensen, retrospektiv eller prospektiv gating av dataene. Alle bildene vil bli rekonstruert med en skivetykkelse på 0,67 mm og en skiveøkning på 0,34 mm. Det komplette datasettet vil bli overført til en dedikert CT-arbeidsstasjon med et 3-dimensjonalt rekonstruksjonsverktøy spesielt designet for koronar angiografi (Philips Intellispace Portal, versjon 7.0) for å tillate multiplanare reformasjoner og kvantitativ plakkanalyse. En uavhengig leser vil gjennomgå alle studiene. Hvert kar som inneholder signifikant stenose vil bli analysert i buede flerplansreformaterte bilder i langakse og tverrsnitt. Diameter på stedet for maksimal stenose og ved proksimale og distale referanser vil bli målt. Grad av stenose vil bli beregnet som forholdet mellom differansen mellom diameteren ved maksimal stenose og gjennomsnittet av diametrene ved de proksimale og distale referansene delt på gjennomsnittet av diametre ved proksimale og distale referanser og uttrykt i prosent. Remodelleringsindeks vil bli beregnet som ytre karareal på stedet for maksimal stenose delt på gjennomsnittet av ytre kararealer ved proksimale og distale referanser. Positiv ombygging vil bli definert som en ombyggingsindeks ≥ 1,05. Plakkvolum vil automatisk beregnes som volumet til alle voksler segmentert mellom de luminale og ytre kargrensene på buede flerplanreformaterte bilder. Proksimale og distale referanser vil bli brukt som de proksimale og distale ender av plakkene. Etterforskerne vil rapportere det totale volumet av plakk og volumer av plakk-undertyper: forkalket, ikke-forkalket og blandet plakk.

Hjertekateterisering og perkutan koronar intervensjon (PCI). Pasienter vil bli innlagt i kateteriseringslaboratoriet i henhold til deres kliniske presentasjon, under hensyntagen til gjeldende ESC/AHA kliniske retningslinjer. Hjertekateteriseringsprosedyren vil bli utført ved bruk av standard perkutane teknikker via arteria radial eller femoral. Koronare lesjoner vil bli evaluert av operatøren med tanke på stenose ved visuell estimering eller annet ved bruk av objektive målinger, for eksempel kvantitativ koronaranalyse (QCA). Koronar intervensjon, inkludert ballongangioplastikk og stentimplantasjon vil bli implementert etter behov og i henhold til alvorlighetsgraden av koronar stenose, dvs. (≥70 % diameter stenose). Tilleggsavbildning av koronar (OCT eller intravaskulær ultralyd) vil bli utført i henhold til operatørens skjønn og uavhengig av studieprotokollen. Alle pasienter vil bli behandlet under prosedyren med antikoagulasjon (for det meste ufraksjonert heparin) med nøye overvåking av aktivert koaguleringstid mellom 250-300 sekunder. Etter angioplastikkprosedyren vil alle pasienter bli behandlet med dobbel anti-blodplatebehandling som kombinerer aspirin og P2Y12-hemmer (klopidogrel, prasugrel eller ticagrelor, i henhold til klinisk indikasjon) i 6-12 måneder, med mindre det vil være kontraindikasjon, som f.eks. behandling med orale antikoagulantia.

Genomisk DNA-ekstraksjon og filtrering. Genomisk DNA fra avføringsprøver vil bli renset ved hjelp av PowerMag Soil DNA-isolasjonssett (MoBio) optimalisert for Tecan automatisert plattform. For haglesekvensering vil 100 ng renset DNA skjæres med en Covaris E220X sonikator.

Mikrobiom analyse. Mikrobiomprøver vil bli behandlet av en automatisert robotrørledning i 96-brønners format. Hver prøvegruppe som samles inn vil bli behandlet robotisk for både 16S og metagenomisk sekvensering.

Generering av mikrobiombaserte funksjoner. Etterforskerne vil bruke og utvide en beregningspipeline som ble utviklet for å generere et rikt sett med funksjoner fra en metagenomisk prøve. Disse funksjonene vil være grunnlaget for modeller som identifiserer mikrobiombaserte signaturer.

Bakteriell og viral overflod - Kartlegging av metagenomprøven til en referansebakteriell genomdatabase, og tell deretter antall avlesninger som kartlegges til hver bakterie, noe som resulterer i en vektor med relativ bakteriemengde for hver prøve.

Bakteriell mangfold - Ved å bruke den relative bakteriemengden som er utledet ovenfor, vil etterforskerne beregne flere mål på mangfoldet av bakterier og virus i en metagenomprøve (f.eks. Shannon-entropi av den relative overflodsvektoren, antall bakterier over et minimumsnivå), som prøvediversitet ble vist å være assosiert med visse fysiologiske aspekter ved verten, slik som generell fettinnhold og insulinresistens.

Bakterieveksthastigheter - For hver metagenomprøve vil etterforskerne beregne en vektor som tilsvarer veksthastigheten til hver bakterie i prøven, ved å bruke en ny metode som nylig ble utviklet for dette formålet. Kort fortalt, ved å undersøke mønsteret for sekvensering av lesedekning (dybde) over lengden av forskjellige bakterielle genomer, fant etterforskerne at mange bakterier viser et prototypisk dekningsmønster, bestående av et enkelt bunn og en enkelt topp. Spesielt faller plasseringen av toppen sammen med bakterienes kjente replikasjonsopprinnelse, noe som antyder at den ekstra lesedekningen nær toppen representerer nylig replikert DNA. For en gitt bakterie varierer forholdet mellom topp- og bunndekning sterkt på tvers av prøver fra forskjellige menneskelige tarmmikrobiomer, med høye forhold som ligner de som oppnås under eksponentiell vekstfase av bakterier dyrket i kultur, og lave forhold ligner vekst i stasjonære bakterier. fase.

Genforekomster - Etterforskerne vil beregne den relative forekomsten av gener i metagenomprøver ved å bruke en lignende tilnærming til den ovenfor for å utlede relativ forekomst av bakterier. For dette formål, i stedet for å kartlegge avlesningene til referansedatabasen for bakterielle genomer, vil etterforskerne kartlegge dem til en referansedatabase med bakteriegener som nylig ble utvidet og som til sammen inneholder over 3 millioner forskjellige bakteriegener. De avledede genoverflodsvektorene er komplementære til bakterieoverflodsvektorene, med fordelen å kartlegge til gener hvis innebygde bakteriegenom er ukjent og dermed tillate mer metagenomsekvensering å bli kartlagt, og med ulempen av å produsere en mye større funksjonsvektor.

Overflod av biologiske veier - Som et annet sett med funksjoner som gir informasjon på det funksjonelle nivået til mikrobiotaen, vil etterforskerne bruke KEGG-databasen over biologiske veier51 og vektoren ovenfor for genoverflod av hver prøve for å beregne en overflodspoeng for hver biologisk vei. Den viktigste fordelen med dette settet med funksjoner er at dets assosiasjoner gir direkte hypoteser angående de underliggende mekanismene som mikrobiotaen kan være involvert i med den korrelerte fenotypen.

Prøvelagring. Prøvene samt gjenværende DNA og frosne serum vil bli lagret i -80C frysere. Ubehandlede avføringsprøver (f.eks. vil ikke alle prøver som samles inn årlig bli behandlet innledningsvis) vil også bli lagret i -800C frysere.

Statistisk analyse. Kliniske data som vitale tegn, kardiovaskulære risikofaktorer (alder, kjønn, lipidprofil, glykemisk indeks, røykestatus, tidligere CAD), kroniske komorbiditeter, regelmessig legemiddelbruk, bildediagnostiske funn på hjerte-CT og/eller hjertekateterisering samt Nivåer av hjerteenzymer vil bli samlet inn ved Rabin Medical Center. Ved Weizmann institutt of science, i informatikkavdelingen ved Segal Lab, vil etterforskerne analysere dataene. For hver parameter vil det bli utført en assosiasjonsanalyser for å identifisere alle mikrobiomparametrene som er assosiert med disse kliniske parameterne.

Etter å ha analysert mikrobiomets signaturer hos de pasientene, der kjente probiotiske og/eller ernæringsmessige intervensjoner kan føre til ønsket endring, vil etterforskerne gripe inn og deretter overvåke med sekvensering av mikrobiomet etter intervensjonen.