人类肠道微生物组是否可以作为冠状动脉粥样硬化的新型个性化治疗靶点？

介绍：

人体胃肠系统中居住着多种共生微生物，即微生物群。 它的总重量约为2公斤，含有数万亿个微生物。 微生物组是微生物群的总遗传（宏基因组）数据。 近年来，基因组测序和生物信息学的高效方法的发展使得微生物组的快速准确定量和定性成为可能，微生物组分析成为微生物群研究的领先方法。

冠状动脉疾病 (CAD) 每年在全球造成超过 800 万人死亡。 特别是，急性冠状动脉综合征 (ACS) 仍然是发病率和死亡率的主要原因，并且每年在美国造成超过 100 万例住院。 ACS 的病理生理学标志是由动脉粥样硬化斑块损伤引起的冠状动脉血栓形成，描述了两种类型的损伤。 第一个是斑块破裂，它仍然是冠状动脉粥样硬化血栓形成的最常见原因，第二个是表面斑块侵蚀，其频率越来越高。 与斑块破裂相反，由侵蚀引起的损伤没有薄的纤维帽、丰富的炎症细胞或大的脂质核心，而是富含细胞外基质，例如蛋白多糖和糖胺聚糖。

影像学研究，如冠状动脉计算机断层扫描血管造影术 (CCTA) 和诊断性冠状动脉导管插入术有或没有光学相干断层扫描 (OCT) 正在临床实践中越来越多地使用，以表征导致不稳定/易损动脉粥样硬化斑块的机制。

人类肠道微生物群通过底物的代谢交换和共代谢与宿主广泛相互作用；从而有助于人体的多种代谢和免疫机制。 CAD 是微生物群研究的一个主要兴趣领域，并且有几项发现将肠道微生物群与 CAD 病理生理学联系起来。 首先，微生物群与代谢综合征有关，即肥胖和胰岛素抵抗。 据推测，肠道微生物群可能会增加短链脂肪酸，最终增加食欲，从而导致肥胖。 另一个假设是肠道微生物群内毒素可能转移到血液中，引发炎症级联反应，最终促进动脉粥样硬化。 其次，微生物群也可能在动脉粥样硬化的发展中发挥作用。 在有症状的动脉粥样硬化患者中，存在一种独特的微生物组模式，可能具有促炎特征。 最近，在心血管风险高的患者中发现了一种独特的微生物模式。 第三，肠道微生物群代谢膳食磷脂酰胆碱（卵磷脂）产生代谢物三甲胺-N-氧化物（TMAO），这与心血管事件风险增加有关。

迄今为止公布的数据仅涉及人体肠道微生物组与心血管危险因素之间的相互作用。 就研究者的知识和理解而言，缺乏对确诊为 CAD（包括 ACS）的患者进行微生物组分析。

目标：

本研究的目的是调查有症状的 CAD 患者的肠道微生物群，包括稳定期和急性期。 研究人员假设，研究参与者将呈现出独特的微生物组特征，这可能提供对动脉粥样硬化 CAD 病理生理学的新见解，同时提供推定的治疗意义。

在大量 CAD 患者中建立独特的微生物组特征后，研究人员将其与 TMAO 水平相关联，以进一步研究其在 CAD 病理生理学中的作用。 在最后阶段，研究人员将尝试找到调整个性化治疗方案的方法，以改变“促动脉粥样硬化”的肠道微生物群。 通过将当前研究的数据与研究人员之前的 1000 名具有已知微生物组和营养状况的患者队列结合使用，它将能够搜索营养干预的特定目标，例如益生菌。 然后，研究人员将在营养干预后通过对微生物组进行测序来监测患者。

方法：

研究设计和招募。 研究参与者将是 30-80 岁因疑似 CAD 来到拉宾医疗中心并能够提供知情同意的患者。 参与者将提供医疗、生活方式和营养调查问卷。 住院期间将进行血压和心率测量，以及血液检查和粪便样本和/或直肠拭子。 为了评估和/或治疗疑似动脉粥样硬化疾病，参与者将根据护理标准并根据治疗心脏病专家的决定进行心脏 CT 和/或心导管插入术。 诊断和治疗方案将仅基于参与者的医疗状况，而不考虑上述研究方案。

将选择对照组来代表没有当前 CAD 的年龄、性别和心血管危险因素匹配组。 对照组的进一步排除标准是在接下来的 3 个月内使用抗生素、炎症性肠病或其他可能影响微生物群的重大慢性疾病（如癌症、自身免疫性疾病和慢性免疫抑制治疗）。 对照组将根据临床怀疑进行心脏 CT 或冠状动脉造影，以排除 CAD，而不管研究方案如何。

血液样本。 10 毫升静脉血将从所有研究参与者的登记患者收集到乙二胺四乙酸 (EDTA) 和含有凝块活化剂的凝胶管中。 血清肌酐、肌钙蛋白、肌酸磷酸激酶（CPK）、血红蛋白、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、葡萄糖、C反应蛋白（ CRP）、b型利钠肽（BNP）和糖化血红蛋白（HbA1C）用全自动生化分析仪测定。

此外，将使用超高效液相色谱-质谱-多反应监测 (UHPLC-MS/MRM) 从血浆中测量 TMAO 的水平，如前所述。

营养分析。 所有参与者将通过填写食物频率问卷 (FFQ) 来报告他们的食物消费习惯。

心脏CT分析。 选定的参与者将使用 256 层系统（Brilliance iCT，Philips Healthcare，俄亥俄州克利夫兰）进行 CT 血管造影以评估和量化 CAD。 数据将通过 96 X 0.625 毫米的准直和 330 毫秒的机架旋转时间获取。 以 5 ml/s 的流速静脉注射 60 至 90 ml 非离子造影剂，然后进行 30 ml 生理盐水快速推注 (3 ml/s)。 将在吸气屏气期间进行采集，同时记录心电图，以便根据心率对数据进行回顾性或前瞻性门控。 所有图像都将以 0.67 毫米的切片厚度和 0.34 毫米的切片增量进行重建。 完整的数据集将传输到专用的 CT 工作站，该工作站具有专为冠状动脉造影设计的 3 维重建工具（Philips Intellispace Portal，7.0 版），以允许进行多平面重建和定量斑块分析。 独立读者将审查所有研究。 将在长轴和横截面视图的弯曲多平面重新格式化图像中分析每条包含明显狭窄的血管。 将测量最大狭窄部位以及近端和远端参考处的直径。 狭窄程度将计算为最大狭窄处的直径与近端和远端参考处的平均直径之间的差异除以近端和远端参考处的平均直径之间的比率，并以百分比表示。 重塑指数将计算为最大狭窄部位的外血管面积除以近端和远端参考处的外血管面积平均值。 正重塑将定义为重塑指数 ≥ 1.05。 斑块体积将自动计算为在弯曲的多平面重新格式化图像上在管腔和外血管边界之间分割的所有体素的体积。 近端和远端参考将用作斑块的近端和远端。 研究人员将报告斑块的总体积和斑块亚型的体积：钙化斑块、非钙化斑块和混合斑块。

心导管术和经皮冠状动脉介入治疗 (PCI)。 考虑到当前的 ESC/AHA 临床指南，患者将根据其临床表现被送入导管实验室。 心脏导管插入术将使用标准经皮技术通过桡动脉或股动脉进行。 冠状动脉病变将由操作者通过视觉估计或其他使用客观测量（例如定量冠状动脉分析（QCA））的狭窄程度进行评估。 冠状动脉介入治疗，包括球囊血管成形术和支架植入术，将根据需要并根据冠状动脉狭窄的严重程度实施，即（≥70% 直径狭窄）。 辅助冠状动脉成像（OCT 或血管内超声）将根据操作者的判断进行，而不管研究方案如何。 所有患者都将在手术过程中接受抗凝治疗（主要是普通肝素），并仔细监测 250-300 秒之间的活化凝血时间。 血管成形术手术后，所有患者将接受联合阿司匹林和 P2Y12 抑制剂（氯吡格雷、普拉格雷或替格瑞洛，根据临床指征）的双重抗血小板治疗 6-12 个月，除非有禁忌症，例如口服抗凝剂治疗。

基因组 DNA 提取和过滤。 来自粪便样本的基因组 DNA 将使用针对 Tecan 自动化平台优化的 PowerMag 土壤 DNA 分离试剂盒 (MoBio) 进行纯化。 对于鸟枪法测序，将使用 Covaris E220X 超声仪剪切 100 ng 纯化的 DNA。

微生物组分析。 微生物组样品将由 96 孔格式的自动化机器人管道处理。 收集的每个样本组都将进行机器人处理，以进行 16S 和宏基因组测序。

生成基于微生物组的特征。 研究人员将采用并进一步扩展计算管道，该管道是为从宏基因组样本中生成一组丰富的特征而开发的。 这些特征将成为识别基于微生物组特征的模型的基础。

细菌和病毒丰度——将宏基因组样本映射到参考细菌基因组数据库，然后计算映射到每个细菌的读数数量，从而得到每个样本的相对细菌丰度向量。

细菌多样性——使用上面推导的相对细菌丰度，研究人员将计算宏基因组样本中细菌和病毒多样性的几种度量（例如，相对丰度向量的香农熵，高于某个最小丰度水平的细菌数量），作为样本多样性被证明与宿主的某些生理方面有关，例如整体肥胖和胰岛素抵抗。

细菌生长率——对于每个宏基因组样本，研究人员将使用最近为此目的开发的一种新方法计算一个与样本中每个细菌的生长率相对应的向量。 简而言之，通过检查跨不同细菌基因组长度的测序读取覆盖率（深度）模式，研究人员发现许多细菌表现出原型覆盖率模式，由单个波谷和单个波峰组成。 值得注意的是，峰的位置与细菌已知的复制起点重合，表明峰附近增加的读取覆盖代表新复制的 DNA。 对于任何给定的细菌，来自不同人类肠道微生物组的样本的峰谷覆盖率之间的比率差异很大，高比率类似于在培养中生长的细菌的指数生长期获得的比率，而低比率类似于静止生长的细菌阶段。

基因丰度——研究人员将通过应用与上述类似的方法来计算宏基因组样本中基因的相对丰度，以推导细菌的相对丰度。 为此，研究人员不会将读数映射到参考细菌基因组数据库，而是将它们映射到最近扩展的细菌基因参考数据库，该数据库总共包含超过 300 万个不同的细菌基因。 衍生的基因丰度向量与细菌丰度向量互补，优点是映射到嵌入细菌基因组未知的基因，从而允许映射更多的宏基因组测序读数，缺点是产生更大的特征向量。

生物通路丰度——作为在微生物群功能层面提供信息的另一组特征，研究人员将使用生物通路的 KEGG 数据库51 和上述每个样本的基因丰度向量来计算每个生物通路的丰度分数。 这组特征的主要优点是它的关联提供了关于微生物群可能与相关表型相关的潜在机制的直接假设。

样品储存。 样本以及剩余的 DNA 和冷冻血清将储存在 -80C 的冰箱中。 未经处理的粪便样本（例如，最初并非每年收集的所有样本都会进行处理）也将储存在 -800C 的冰箱中。

统计分析。 临床数据，例如生命体征、心血管危险因素（年龄、性别、血脂状况、血糖指数、吸烟状况、既往 CAD）、慢性合并症、经常吸毒、心脏 CT 和/或心导管检查的影像学发现以及心肌酶水平将在拉宾医疗中心收集。 在魏茨曼科学研究所西格尔实验室的计算机科学系，研究人员将分析数据。 对于每个参数，将进行关联分析以确定与这些临床参数相关的所有微生物组参数。

在分析了那些已知的益生菌和/或营养干预可以导致预期变化的患者的微生物组特征后，研究人员将进行干预，然后在干预后通过对微生物组进行测序进行监测。