인간 장내 마이크로바이옴은 관상동맥 죽상경화증에 대한 새로운 맞춤형 치료 표적 역할을 합니까?

소개:

인간의 위장 시스템은 다양한 공생 미생물, 즉 미생물총으로 채워져 있습니다. 총 무게는 약 2kg이며 수조 개의 미생물을 포함합니다. 마이크로바이옴은 미생물군 전체의 유전적(메타게노믹) 데이터입니다. 최근 몇 년 동안 게놈 시퀀싱 및 생물 정보학을 위한 효율적인 방법의 개발로 미생물의 빠르고 정확한 정량화 및 자격이 가능해졌으며 미생물 분석이 미생물 연구의 선도적인 방법이 되었습니다.

관상 동맥 질환(CAD)은 전 세계적으로 매년 800만 명 이상의 사망자를 발생시킵니다. 특히 급성 관상동맥 증후군(ACS)은 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있으며 매년 미국에서 100만 명 이상의 병원 입원을 담당하고 있습니다. ACS의 병태생리학적 특징은 죽상경화판 손상으로 인한 관상동맥 혈전증이며 두 가지 유형의 손상이 설명되어 있습니다. 첫 번째는 관상 동맥 죽상 혈전증의 가장 흔한 원인으로 남아 있는 플라크 파열이고, 두 번째는 빈도가 증가함에 따라 인식되는 표재성 플라크 미란입니다. 플라크 파열과 반대로 침식으로 인한 병변은 얇은 섬유질 캡, 풍부한 염증 세포 또는 큰 지질 코어를 갖지 않고 오히려 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포외 기질이 풍부합니다.

불안정/취약한 죽상경화반의 원인이 되는 기전을 규명하기 위해 CCTA(관상 컴퓨터 단층 혈관 조영술) 및 광간섭 단층 촬영(OCT)을 포함하거나 포함하지 않는 진단용 관상 동맥 카테터 삽입과 같은 영상 연구가 임상 실습에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다.

인간 장내 미생물군은 기질의 대사 교환 및 공동 대사를 통해 숙주와 광범위하게 상호 작용합니다. 따라서 인체의 다양한 대사 및 면역 메커니즘에 기여합니다. CAD는 미생물군 연구에서 주요 관심 분야이며 장내 미생물군을 CAD 병리생리학과 연결하는 몇 가지 발견이 있습니다. 첫째, 미생물총은 대사 증후군, 즉 비만 및 인슐린 저항성과 관련이 있습니다. 장내 미생물총이 단쇄 지방산을 증가시켜 결국 식욕을 증가시켜 비만을 유발할 수 있다는 가설이 있습니다. 또 다른 가설은 장내 미생물총 내독소가 혈류로 이동하여 결국 죽상동맥경화증을 촉진하는 염증성 캐스케이드를 유발할 수 있다는 것입니다. 둘째, 미생물군은 죽상동맥경화증 발병에 역할을 할 수도 있습니다. 증상이 있는 죽상동맥경화증 환자의 경우 전 염증 특성을 가질 수 있는 독특한 미생물 군집 패턴이 있습니다. 최근 심혈관 위험도가 높은 환자들 사이에서 독특한 미생물 패턴이 발견되었습니다. 셋째, 장내 미생물군은 식이성 포스파티딜콜린(레시틴)을 대사하여 심혈관 사건의 위험 증가와 관련된 대사물 트리메틸아민-N-옥사이드(TMAO)를 생성합니다.

지금까지 발표된 데이터는 인간 장내 미생물과 심혈관 위험 요인 간의 상호작용에만 관련되어 있습니다. 연구자의 지식과 이해를 바탕으로 CAD(ACS 포함) 진단이 확립된 환자의 미생물군집 분석이 부족합니다.

목표:

현재 연구의 목적은 안정기 및 급성기 모두에서 증상이 있는 CAD 환자의 장내 미생물을 조사하는 것입니다. 연구자들은 연구 참여자들이 죽상동맥경화증 CAD의 병리생리학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있는 독특한 미생물군집 특징을 제시하면서 추정되는 치료적 의미를 제공할 것이라고 가정합니다.

CAD 환자의 대규모 코호트에서 고유한 마이크로바이옴 시그니처를 확립한 후 연구자들은 CAD의 병태생리학에서 그 부분을 추가로 조사하기 위해 이를 TMAO 수준과 연관시킬 것입니다. 마지막 단계에서 조사관은 "죽상경화증" 장내 미생물군을 변경하기 위해 개인화된 치료 옵션을 조정하는 방법을 찾으려고 노력할 것입니다. 마이크로바이옴과 영양 프로필이 알려진 연구자의 이전 1000명의 환자 코호트와 함께 현재 연구의 데이터를 사용하여 프로바이오틱스와 같은 영양 개입을 위한 특정 대상을 검색할 수 있습니다. 그런 다음 조사관은 영양 개입 후 미생물 군집을 시퀀싱하여 환자를 모니터링합니다.

행동 양식:

연구 설계 및 모집. 연구 참가자는 CAD가 의심되는 Rabin Medical Center에 도착하고 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있는 30-80세의 환자입니다. 참가자는 의료, 생활 방식 및 영양 설문지를 제공합니다. 혈압 및 심박수 측정은 입원 기간 동안 뿐만 아니라 혈액 검사 및 대변 샘플 및/또는 직장 면봉으로 이루어집니다. 죽상동맥경화증이 의심되는 질병을 평가 및/또는 치료하기 위해 참가자는 치료 표준에 따라 치료 심장 전문의의 결정에 따라 심장 CT 및/또는 심장 카테터 삽입술을 받게 됩니다. 진단 및 치료 옵션은 앞서 언급한 연구 프로토콜과 상관없이 참가자의 의학적 상태만을 기반으로 합니다.

대조군은 현재 CAD가 없는 연령, 성별 및 심혈관 위험 요인과 일치하는 그룹을 나타내도록 선택됩니다. 대조군의 추가 제외 기준은 다음 3개월 동안의 항생제 소비, 염증성 장 질환 또는 미생물군에 영향을 미칠 수 있는 기타 중요한 만성 질환(예: 암, 자가 면역 질환 및 만성 면역 억제 치료)입니다. 대조군은 연구 프로토콜과 관계없이 CAD를 배제하기 위해 임상적 의심에 따라 심장 CT 또는 관상 동맥 조영술을 받을 것입니다.

혈액 샘플. 10ml의 정맥혈을 모든 연구 참가자의 등록된 환자로부터 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 응고 활성화제 함유 튜브가 있는 겔에 수집합니다. 혈청 크레아티닌, 트로포닌, 크레아틴 포스포키나제(CPK), 헤모글로빈, 트리글리세리드(TG), 총 콜레스테롤(TC), 고밀도 지단백질(HDL), 저밀도 지단백질(LDL), 포도당, c-반응성 단백질( CRP), b형 나트륨이뇨펩티드(BNP) 및 헤모글로빈 A1c(HbA1C)는 자동 생화학 분석기로 측정됩니다.

또한 TMAO 수준은 이전에 설명한 대로 초고성능 액체 크로마토그래피 - 질량 분석 - 다중 반응 모니터링(UHPLC-MS/MRM)을 사용하여 혈장에서 측정됩니다.

영양 프로파일링. 모든 참가자는 FFQ(Food Frequency Questionnaire)를 작성하여 음식 소비 습관을 보고합니다.

심장 CT 분석. 선택된 참가자는 256-슬라이스 시스템(Brilliance iCT, Philips Healthcare, Cleveland, Ohio)을 사용하여 CAD의 평가 및 정량화를 위해 CT 혈관조영술을 받게 됩니다. 데이터는 96 X 0.625mm의 시준과 330ms의 갠트리 회전 시간으로 수집됩니다. 비이온성 조영제 60~90ml를 5ml/s의 유속으로 정맥 주사한 다음 30ml 식염수 체이스 볼루스(3ml/s)를 주입합니다. 수집은 심박수에 따라 데이터의 후향적 또는 전향적 게이팅을 허용하기 위해 동시에 심전도가 기록되는 동안 흡기 정지 동안 수행됩니다. 모든 이미지는 0.67mm의 슬라이스 두께와 0.34mm의 슬라이스 증분으로 재구성됩니다. 전체 데이터 세트는 관상 동맥 조영술(Philips Intellispace Portal, 버전 7.0)을 위해 특별히 설계된 3차원 재구성 도구가 있는 전용 CT 워크스테이션으로 전송되어 다중 평면 재구성 및 정량적 플라크 분석이 가능합니다. 독립 독자가 모든 연구를 검토합니다. 상당한 협착증을 포함하는 각 혈관은 장축 및 단면 보기에서 구부러진 다중 평면 재구성 이미지로 분석됩니다. 최대 협착 부위와 근위부 및 원위부 기준의 직경을 측정합니다. 협착 정도는 최대 협착시 직경과 근위 및 원위 기준 직경의 평균 차이를 근위 및 원위 기준 직경의 평균으로 나눈 비율로 계산하고 백분율로 표시합니다. 리모델링 지수는 최대 협착 부위의 외부 혈관 면적을 근위부 및 원위부 참조의 외부 혈관 면적의 평균으로 나눈 값으로 계산됩니다. 긍정적인 리모델링은 리모델링 지수 ≥ 1.05로 정의됩니다. 플라크 부피는 곡선 다중 ​​평면 재포맷 이미지에서 내강과 외부 혈관 경계 사이에 분할된 모든 복셀의 부피로 자동 계산됩니다. 근위 및 원위 참조는 플라크의 근위 및 원위 끝으로 사용됩니다. 조사관은 플라크의 총 부피와 플라크 하위 유형의 부피를 보고합니다: 석회화, 비석회화 및 혼합 플라크.

심장 도관술 및 경피적 관상동맥 중재술(PCI). 환자는 현재 ESC/AHA 임상 지침을 고려하여 임상 증상에 따라 도뇨 검사실에 입원하게 됩니다. 심장 카테터 삽입 절차는 요골 또는 대퇴 동맥을 통해 표준 경피 기술을 사용하여 수행됩니다. 관상 병변은 육안 평가 또는 정량적 관상 분석(QCA)과 같은 객관적인 측정을 사용하여 시술자가 협착의 관점에서 평가할 것입니다. 풍선 혈관성형술 및 스텐트 삽입술을 포함한 관상동맥 중재술은 필요에 따라 관상동맥 협착증의 중증도, 즉(직경 70% 이상의 협착증)에 따라 시행됩니다. 보조 관상동맥 영상화(OCT 또는 혈관내 초음파)는 조작자의 재량에 따라 그리고 연구 프로토콜에 관계없이 수행될 것입니다. 모든 환자는 250-300초 사이의 활성화된 응고 시간을 주의 깊게 모니터링하여 항응고제(대부분 미분획 헤파린)로 절차 중에 치료를 받게 됩니다. 혈관성형술 후 모든 환자는 아스피린과 P2Y12억제제(임상 적응증에 따라 클로피도그렐, 프라수그렐 또는 티카그렐로)를 병용하는 이중 항혈소판 요법으로 6~12개월간 치료를 받는다. 경구 항응고제로 치료.

게놈 DNA 추출 및 필터링. 대변 ​​샘플의 게놈 DNA는 Tecan 자동화 플랫폼에 최적화된 PowerMag Soil DNA 분리 키트(MoBio)를 사용하여 정제됩니다. 샷건 시퀀싱의 경우 100ng의 정제된 DNA를 Covaris E220X 초음파기로 전단합니다.

마이크로바이옴 분석. Microbiome 샘플은 96웰 형식의 자동화된 로봇 파이프라인으로 처리됩니다. 수집된 각 샘플 그룹은 16S 및 metagenomic 시퀀싱 모두를 위해 로봇 방식으로 처리됩니다.

마이크로바이옴 기반 기능 생성. 조사관은 metagenomic 샘플에서 풍부한 기능 세트를 생성하기 위해 개발된 계산 파이프라인을 사용하고 추가로 확장할 것입니다. 이러한 기능은 마이크로바이옴 기반 서명을 식별하는 모델의 기초가 될 것입니다.

박테리아 및 바이러스 풍부 - 메타게놈 샘플을 참조 박테리아 게놈 데이터베이스에 매핑한 다음 각 박테리아에 매핑된 판독 수를 계산하여 각 샘플에 대한 상대적 박테리아 풍부 벡터를 생성합니다.

박테리아 다양성 - 위에서 도출한 상대적인 박테리아 풍부도를 사용하여 조사자는 메타게놈 샘플에서 박테리아와 바이러스의 다양성에 대한 여러 척도를 계산합니다(예: 상대적 존재도 벡터의 Shannon 엔트로피, 최소 존재도 수준 이상의 박테리아 수). 샘플 다양성은 전반적인 비만 및 인슐린 저항성과 같은 숙주의 특정 생리학적 측면과 관련이 있는 것으로 나타났습니다.

박테리아 성장률 - 각 메타게놈 샘플에 대해 조사관은 이 목적을 위해 최근에 개발된 새로운 방법을 사용하여 샘플에 있는 각 박테리아의 성장률에 해당하는 벡터를 계산합니다. 간단히 말해서, 다양한 박테리아 게놈의 길이에 걸쳐 시퀀싱 판독 범위(깊이)의 패턴을 조사함으로써 연구자들은 많은 박테리아가 단일 골과 단일 피크로 구성된 원형 커버리지 패턴을 나타냄을 발견했습니다. 특히, 피크의 위치는 박테리아의 알려진 복제 기원과 일치하며 피크 근처에 추가된 판독 범위가 새로 복제된 DNA를 나타냄을 시사합니다. 주어진 박테리아에 대해 최고점과 최저점 범위 사이의 비율은 다른 인간 장내 미생물 군집의 샘플에 따라 크게 다릅니다. 높은 비율은 배양에서 성장한 박테리아의 기하급수적 성장 단계에서 얻은 것과 유사하고 낮은 비율은 정지 상태에서의 성장과 유사합니다. 단계.

유전자 풍부도 - 조사관은 박테리아의 상대적 풍부도를 도출하기 위해 위와 유사한 접근 방식을 적용하여 메타게놈 샘플에서 유전자의 상대적 풍부도를 계산합니다. 이를 위해 판독값을 참조 박테리아 게놈 데이터베이스에 매핑하는 대신 조사관은 최근에 확장되고 집합적으로 3백만 개 이상의 개별 박테리아 유전자를 포함하는 박테리아 유전자의 참조 데이터베이스에 매핑할 것입니다. 파생된 유전자 풍부 벡터는 박테리아 풍부 벡터에 상보적이며, 박테리아 게놈이 포함되어 있지 않은 유전자에 매핑되는 이점이 있어 더 많은 메타게놈 시퀀싱 판독이 매핑될 수 있으며 훨씬 더 큰 특징 벡터를 생성하는 단점이 있습니다.

생물학적 경로 존재비 - 미생물의 기능적 수준에서 정보를 제공하는 또 다른 기능 세트로서 조사관은 생물학적 경로의 KEGG 데이터베이스51와 각 샘플의 유전자 존재비 벡터를 사용하여 각 생물학적 경로에 대한 존재비 점수를 계산합니다. 이 기능 세트의 주요 이점은 그 연관성이 미생물군이 상관 표현형과 관련될 수 있는 기본 메커니즘에 관한 직접적인 가설을 제공한다는 것입니다.

샘플 보관. 샘플과 나머지 DNA 및 냉동 혈청은 -80C 냉동고에 보관됩니다. 처리되지 않은 대변 샘플(예: 매년 수집된 모든 샘플이 처음에 처리되는 것은 아님)도 -800C 냉동고에 보관됩니다.

통계 분석. 활력 징후, 심혈관 위험 인자(연령, 성별, 지질 프로필, 혈당 지수, 흡연 여부, 이전 CAD), 만성 동반 질환, 규칙적인 약물 사용, 심장 CT 및/또는 심장 카테터 삽입에 대한 영상 소견과 같은 임상 데이터 심장 효소 수치는 Rabin Medical Center에서 수집됩니다. Weizmann 연구소의 Segal Lab 컴퓨터 과학 부서에서 조사관이 데이터를 분석합니다. 각 매개변수에 대해 연관 분석을 수행하여 이러한 임상 매개변수와 관련된 모든 미생물 매개변수를 식별합니다.

알려진 프로바이오틱 및/또는 영양 개입이 원하는 변화로 이어질 수 있는 환자의 미생물 시그니처를 분석한 후 조사관이 개입한 다음 개입 후 미생물을 시퀀싱하여 모니터링합니다.