Zásoby vitamínu A v játrech a sérové ​​markery vitamínu A u dospělých v USA v době smrti

Ve srovnání s krevními biomarkery existuje minimum údajů o skutečném jaterním vitaminu A u lidí. Jeden krevní biomarker, procento celkového sérového retinolu (vitamínu A) ve formě retinylesterů, byl navržen pro diagnostiku hypervitaminózy A s hraničními hodnotami 5 % a 10 %. V této studii se výzkumníci zaměřují na srovnání celkových jaterních rezerv vitaminu A s procentem celkového sérového retinolu jako retinylesterů pro hodnocení hypervitaminózy A pomocí pitevních vzorků od dospělých v USA. Vyšetřovatelé také hodnotí senzitivitu (schopnost biomarkeru správně identifikovat osoby s deficitem) a specificitu (schopnost biomarkeru správně identifikovat osoby bez deficitu) sérového retinolu za účelem stanovení deficitu vitaminu A, kolísání koncentrace vitaminu A v játrech mezi laloky. a koncentrace alfa retinyl esteru v játrech, produkt štěpení alfa-karotenu, prekurzoru vitaminu A.

K provedení studie byly získány odpovídající vzorky séra a jater od 27 dospělých mrtvol v USA (od dárců ve věku 49-101 let) a byly analyzovány jejich biomarkery vitaminu A. Odpovídající vzorky lidských jater a séra byly odebrány od 27 mrtvol, 13 mužů a 14 žen, a získány jako po sobě jdoucí vzorek prostřednictvím požadavku na službu National Disease Research Interchange. Byly také získány neidentifikované souhrny klinické anamnézy. Kritéria dárce byla následující: bez omezení rasy nebo pohlaví, bez anamnézy chemoterapie a/nebo ozařování, bez anamnézy prodloužené endotracheální intubace nebo ventilace, bez známek sepse nebo infekčního onemocnění (negativní sérologický panel) a věkové rozmezí 21 let -54 let, 55-74 let a >75 let (cílový odběr byl 5 mužských a 5 ženských dárců na věkové rozmezí, aby byl poskytnut nehomogenní vzorek). Poté, co bylo získáno 10 jedinců v každém věkovém rozmezí (tj. 55-74 let a >75 let), vzorky již nebyly požadovány. Všechny tkáně a séra byly odebrány do 16 hodin post mortem od září 2013 do srpna 2016. Čísla protokolu odběru byla DWEN1 002 022, 002 023 a 002 024 pro zmrazená játra, zalitá játra a sérum. Vzorky séra byly izolovány gelovou separací a poté zmrazeny; primární vzorky jater byly bleskově zmraženy v kapalném N2; druhý vzorek jater od každého dárce byl zalit do směsi pro optimální teplotu řezání (OCT) a rychle zmražen v kryoformě. Dvě játra byla získána téměř celá a hodnocena na distribuci VA uvnitř a mezi laloky. Vzorky byly odeslány na suchém ledu do Madison, WI a skladovány v mrazáku -80 °C.

Vzorky jater zalité do OCT byly připraveny jako 5-um zmrazené řezy za použití kryostatu a obarveny pomocí rutinního hematoxylinu a eosinu a Massonových trichromových protokolů a činidel (Newcomer Supply, Middleton, WI). Snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Nikon E-600 s jasným polem (Melville, NY) a digitální mikroskopické kamery Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Vzorky jater (1 g) pro analýzu VA a karotenoidů byly zváženy a poté rozemlety se síranem sodným (4-5 g) v třecí misce a tloučku za použití publikovaných metod s malými modifikacemi. Ke stanovení účinnosti extrakce byl přidán purifikovaný C-23 beta-apo-karotenol. Vzorky byly opakovaně extrahovány dichlormethanem a filtrovány přes Whatman™ #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) do 50ml odměrných baněk. Alikvot (5 ml) byl sušen pod dusíkem, znovu rozpuštěn ve 300 ul methanol:dichlorethan (75:25, objem:objem) a alikvotní podíl 1 ul byl nastříknut do ultratlakového kapalinového chromatografu Waters Acquity H-Class ( UPLC®) systém vybavený detektorem fotodiodového pole (Milford, MA). Alikvoty byly dále zmýdelněny pro kvantifikaci celkového alfa-retinolu, jak je popsáno níže pro lalokové analýzy. Pro hodnocení vzorků jaterního laloku byly 1 g vzorky extrahovány trojmo z každého dostupného laloku. 5ml alikvot extraktu byl zmýdelněn 400 ml hydroxidu draselného:voda (50:50, hmotnost:objem) při 45 °C po dobu 1 hodiny. Reakce byla zastavena 0,5 ml vody a extrahována třikrát 0,5 ml hexanů. Hexanové vrstvy byly spojeny a sušeny pod dusíkem, znovu rozpuštěny ve 150 ul methanol:dichlorethan (75:25, objem:objem) a alikvotní podíl 1 ul byl injikován do systému UPLC®.

Vzorky séra (0,5 ml) byly rozděleny do alikvotů do zkumavek pro stanovení retinolu a RE; K denaturaci proteinů bylo přidáno 1,25 x objemu ethanolu. Vnitřní standard byl C23-p-apo-karotenol. Vzorky byly extrahovány třikrát 0,75 ml hexanů; frakce supernatantu byly spojeny a sušeny pod dusíkem a rekonstituovány ve 100 ul methanol:dichlorethan (75:25, objem:objem). Dva ul byly injikovány do UPLC® za podmínek popsaných níže. Sérový C-reaktivní protein (CRP) a alfa1-kyselý glykoprotein (AGP) byly analyzovány pro hodnocení zánětu pomocí souprav ELISA (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Koncentrace lykopenu a alfa- a beta-karotenu byly stanoveny rutinní HPLC analýzou.

Metoda ultra-vysokoúčinného kapalinového chromatografu (UPLC) A Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 um předkolona VanGuard byla použita ve spojení s Waters Acquity UPLC® HSS C18 kolonou (1,8 um, 2,1 x 150 mm). Metoda využívala dvě směsi rozpouštědel naprogramované na 29minutový gradient. Rozpouštědlem A byl acetonitril-voda-isopropanol (70:25:5, objem:objem:objem) s 10 mmol/l octanu amonného a rozpouštědlem B byl methanol-isopropanol (75:25, objem:objem). Teplota kolony byla nastavena na 32 °C a průtoková rychlost byla 0,4 ml/min. Gradient začal držením 100% rozpouštědla A po dobu 7 minut, následoval 4minutový lineární přechod na 5% A a další přechod na 1% A během 12 minut. Gradient rozpouštědla byl poté obrácen na 100 % A během 2 minut a ekvilibrován po dobu 4 minut. Chromatogramy byly generovány při 311 nm pro a-retinol a a-RE, 325 nm pro retinol a RE a 450 nm pro karotenoidy. alfa-RE, pocházející téměř výlučně z beta-karotenu ve stravě, byly kvantifikovány jako proxy pro dlouhodobou expozici zelenině. Koncentrace byly vypočteny za použití standardních křivek odvozených z autentických HPLC-čištěných standardů a-retinolu a retinolu.