Riserve epatiche di vitamina A e marcatori sierici di vitamina A negli adulti statunitensi al momento della morte

Esistono dati umani minimi sulla vitamina A epatica effettiva rispetto ai biomarcatori del sangue. Un biomarcatore del sangue, la percentuale di retinolo sierico totale (vitamina A) sotto forma di esteri retinilici, è stato suggerito per diagnosticare l'ipervitaminosi A con cutoff del 5% e del 10%. In questo studio, i ricercatori mirano a confrontare le riserve totali di vitamina A nel fegato con la percentuale totale di retinolo sierico come esteri retinilici per valutare l'ipervitaminosi A utilizzando campioni autoptici di adulti statunitensi. Gli investigatori valutano anche la sensibilità (la capacità del biomarcatore di identificare correttamente quelli con carenza) e la specificità (la capacità del biomarcatore di identificare correttamente quelli senza carenza) del retinolo sierico per determinare la carenza di vitamina A, la variazione della concentrazione di vitamina A nel fegato tra i lobi e concentrazioni epatiche di alfa retinil estere, un prodotto di scissione dell'alfa-carotene, un precursore della vitamina A.

Per condurre lo studio, campioni di siero e fegato abbinati sono stati prelevati da 27 cadaveri adulti statunitensi (da donatori di età compresa tra 49 e 101 anni) e sono stati analizzati i loro biomarcatori di vitamina A. Campioni di fegato umano e siero corrispondenti sono stati raccolti da 27 cadaveri, 13 maschi e 14 femmine, e acquisiti come campione consecutivo attraverso una richiesta al servizio nazionale di interscambio per la ricerca sulle malattie. Sono stati ottenuti anche riassunti della storia clinica non identificati. I criteri del donatore erano i seguenti: nessuna restrizione di razza o sesso, nessuna storia di chemioterapia e/o radiazioni, nessuna storia di intubazione o ventilazione endotracheale prolungata, nessuna evidenza di sepsi o malattia infettiva (pannello sierologico negativo) e fasce di età di 21 anni -54 anni, 55-74 anni e >75 anni (la raccolta target era di 5 donatori maschi e 5 femmine per fascia di età per fornire un campione non omogeneo). Dopo che sono stati acquisiti 10 individui in ciascuna fascia di età (ovvero 55-74 anni e >75 anni), i campioni non sono stati più richiesti. Tutti i tessuti e i sieri sono stati prelevati entro 16 ore post mortem da settembre 2013 ad agosto 2016. I numeri del protocollo di approvvigionamento erano DWEN1 002 022, 002 023 e 002 024 rispettivamente per fegato congelato, fegato incorporato e siero. I campioni di siero sono stati isolati mediante separazione su gel e quindi congelati; i campioni primari di fegato sono stati congelati a scatto in N2 liquido; un secondo campione di fegato di ciascun donatore è stato incorporato in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelato a scatto in un cryomold. Due fegati sono stati prelevati quasi interi e valutati per la distribuzione di VA all'interno e tra i lobi. I campioni sono stati spediti su ghiaccio secco a Madison, WI, e conservati in un congelatore a -80°C.

I campioni di fegato incorporati con OCT sono stati preparati come sezioni congelate da 5 μm utilizzando un criostato e colorati utilizzando ematossilina ed eosina di routine e protocolli e reagenti tricromici di Masson (Newcomer Supply, Middleton, WI). Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a campo chiaro Nikon E-600 (Melville, NY) e una fotocamera per microscopia digitale Olympus DP-71 (Center Valley, PA). I campioni di fegato (1 g) per le analisi di VA e carotenoidi sono stati pesati e quindi macinati con solfato di sodio (4-5 g) in un mortaio e un pestello utilizzando metodi pubblicati con modifiche minori. È stato aggiunto C-23 beta-apo-carotenolo purificato per determinare l'efficienza di estrazione. I campioni sono stati estratti ripetutamente con diclorometano e filtrati attraverso WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) in matracci tarati da 50 mL. Un'aliquota (5 mL) è stata essiccata sotto azoto, ridisciolta in 300 µL di metanolo:dicloroetano (75:25, volume:volume) e un'aliquota di 1 µL è stata iniettata in un cromatografo liquido ad altissima pressione Waters Acquity H-Class ( UPLC®) dotato di un rivelatore a serie di fotodiodi (Milford, MA). Le aliquote sono state ulteriormente saponificate per la quantificazione dell'alfa-retinolo totale come descritto di seguito per le analisi dei lobi. Per le valutazioni del campione del lobo epatico, campioni da 1 g sono stati estratti in triplicato da ciascun lobo disponibile. Un'aliquota di 5 mL dell'estratto è stata saponificata con 400 mL di idrossido di potassio:acqua (50:50, peso:volume) a 45°C per 1 ora. La reazione è stata spenta con 0,5 mL di acqua ed estratta tre volte con 0,5 mL di esani. Gli strati di esano sono stati riuniti ed essiccati sotto azoto, ridisciolti in 150 µL di metanolo:dicloroetano (75:25, volume:volume) e un'aliquota di 1 µL è stata iniettata nel sistema UPLC@.

I campioni di siero (0,5 mL) sono stati aliquotati in provette per la determinazione del retinolo e del RE; 1,25 volte il volume di etanolo è stato aggiunto alle proteine ​​denaturate. Lo standard interno era C23-β-apo-carotenolo. I campioni sono stati estratti tre volte con 0,75 mL di esano; le frazioni surnatanti sono state riunite ed essiccate sotto azoto e ricostituite in 100 µL di metanolo: dicloroetano (75:25, volume:volume). Due µL sono stati iniettati nell'UPLC® nelle condizioni descritte di seguito. La proteina C-reattiva del siero (CRP) e la glicoproteina acida alfa1 (AGP) sono state analizzate per valutare l'infiammazione utilizzando i kit ELISA (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Le concentrazioni di licopene e alfa e beta-carotene sono state determinate mediante analisi HPLC di routine.

Metodo UPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatograph) Una precolonna VanGuard Waters Acquity UPLC HSS C18 da 1,8 µm è stata utilizzata insieme a una colonna Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). Il metodo utilizzava due miscele di solventi programmate per un gradiente di 29 minuti. Il solvente A era acetonitrile-acqua-isopropanolo (70:25:5, volume:volume:volume) con 10 mmol/L di acetato di ammonio e il solvente B era metanolo-isopropanolo (75:25, volume:volume). La temperatura della colonna è stata impostata a 32°C e la portata era di 0,4 mL/min. Il gradiente è iniziato mantenendo il 100% di solvente A per 7 minuti, seguito da una transizione lineare di 4 minuti al 5% di A e un'altra transizione all'1% di A in 12 minuti. Il gradiente del solvente è stato quindi invertito al 100% A in 2 minuti ed equilibrato per 4 minuti. I cromatogrammi sono stati generati a 311 nm per α-retinolo e α-RE, 325 nm per retinolo e RE e 450 nm per i carotenoidi. Gli alfa-RE, derivati ​​quasi esclusivamente dal beta-carotene nella dieta, sono stati quantificati come proxy per l'esposizione vegetale a lungo termine. Le concentrazioni sono state calcolate utilizzando curve standard derivate da autentici standard purificati HPLC di α-retinolo e retinolo.