Vitamin-A-Leberreserven und Serummarker von Vitamin A bei US-Erwachsenen zum Zeitpunkt des Todes

Es liegen nur wenige Humandaten zum tatsächlichen Leber-Vitamin A im Vergleich zu Blut-Biomarkern vor. Ein Blut-Biomarker, der Prozentsatz des gesamten Serum-Retinols (Vitamin A) in Form von Retinylestern, wurde vorgeschlagen, um Hypervitaminose A mit Grenzwerten von 5 % und 10 % zu diagnostizieren. In dieser Studie zielen die Forscher darauf ab, die gesamten Leber-Vitamin-A-Reserven mit dem prozentualen Gesamtserum-Retinol als Retinylester zu vergleichen, um die Hypervitaminose A anhand von Autopsieproben von US-Erwachsenen zu bewerten. Die Forscher bewerten auch die Sensitivität (die Fähigkeit des Biomarkers, diejenigen mit Mangel korrekt zu identifizieren) und die Spezifität (die Fähigkeit des Biomarkers, diejenigen ohne Mangel korrekt zu identifizieren) von Serum-Retinol, um einen Vitamin-A-Mangel und eine Variation der Vitamin-A-Konzentration in der Leber zwischen den Lappen zu bestimmen und Leber-Alpha-Retinylester-Konzentrationen, ein Spaltprodukt von Alpha-Carotin, einem Vitamin-A-Vorläufer.

Zur Durchführung der Studie wurden übereinstimmende Serum- und Leberproben von 27 erwachsenen US-Kadavern (von Spendern im Alter von 49 bis 101 Jahren) beschafft und ihre Vitamin-A-Biomarker analysiert. Abgestimmte menschliche Leber- und Serumproben wurden von 27 Leichen, 13 männlichen und 14 weiblichen, entnommen und als fortlaufende Probe auf Anfrage beim National Disease Research Interchange Service erworben. Anonymisierte Zusammenfassungen der klinischen Vorgeschichte wurden ebenfalls erhalten. Die Spenderkriterien waren wie folgt: keine Beschränkungen hinsichtlich Rasse oder Geschlecht, keine Chemotherapie und/oder Bestrahlung in der Vorgeschichte, keine verlängerte endotracheale Intubation oder Beatmung in der Vorgeschichte, kein Anzeichen einer Sepsis oder Infektionskrankheit (negatives serologisches Panel) und Altersbereiche von 21 Jahren -54 Jahre, 55-74 Jahre und >75 Jahre (Zielsammlung war 5 männliche und 5 weibliche Spender pro Altersgruppe, um eine nicht homogene Stichprobe bereitzustellen). Nachdem 10 Personen in jeder Altersgruppe (d. h. 55–74 Jahre und >75 Jahre) erfasst wurden, wurden keine Proben mehr angefordert. Alle Gewebe und Seren wurden von September 2013 bis August 2016 innerhalb von 16 h post mortem beschafft. Die Beschaffungsprotokollnummern waren DWEN1 002 022, 002 023 und 002 024 für gefrorene Leber, eingebettete Leber bzw. Serum. Serumproben wurden durch Geltrennung isoliert und dann eingefroren; primäre Leberproben wurden in flüssigem N2 schockgefroren; Eine zweite Leberprobe von jedem Spender wurde in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) eingebettet und in einer Kryomform schockgefroren. Zwei Lebern wurden fast vollständig beschafft und auf VA-Verteilung innerhalb und zwischen Lappen untersucht. Die Proben wurden auf Trockeneis nach Madison, WI, versandt und in einem -80°C Gefrierschrank gelagert.

OCT-eingebettete Leberproben wurden als gefrorene 5-µm-Schnitte unter Verwendung eines Kryostaten präpariert und unter Verwendung von routinemäßigen Hämatoxylin- und Eosin- und Masson-Trichromprotokollen und -reagenzien (Newcomer Supply, Middleton, WI) gefärbt. Bilder wurden unter Verwendung eines Nikon E-600 Hellfeldmikroskops (Melville, NY) und einer Olympus DP-71 Digitalmikroskopkamera (Center Valley, PA) aufgenommen. Leberproben (1 g) für VA- und Carotinoidanalysen wurden gewogen und dann mit Natriumsulfat (4–5 g) in einem Mörser und Stößel unter Verwendung veröffentlichter Verfahren mit geringfügigen Modifikationen gemahlen. Gereinigtes C-23-Beta-Apo-Carotinol wurde hinzugefügt, um die Extraktionseffizienzen zu bestimmen. Die Proben wurden wiederholt mit Dichlormethan extrahiert und durch WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) in 50-ml-Messkolben filtriert. Ein Aliquot (5 ml) wurde unter Stickstoff getrocknet, in 300 &mgr;l Methanol:Dichlorethan (75:25, Volumen:Volumen) wieder aufgelöst und ein Aliquot von 1 &mgr;l wurde in einen Waters Acquity H-Class-Ultradruck-Flüssigkeitschromatographen ( UPLC®)-System, ausgestattet mit einem Photodioden-Array-Detektor (Milford, MA). Aliquots wurden zur Quantifizierung des gesamten alpha-Retinols weiter verseift, wie unten für die Lappenanalysen beschrieben. Für die Auswertungen der Leberlappenproben wurden 1-g-Proben dreifach aus jedem verfügbaren Lappen entnommen. Ein 5-ml-Aliquot des Extrakts wurde mit 400 ml Kaliumhydroxid:Wasser (50:50, Gewicht:Volumen) bei 45°C für 1 h verseift. Die Reaktion wurde mit 0,5 ml Wasser gequencht und dreimal mit 0,5 ml Hexanen extrahiert. Die Hexanschichten wurden gepoolt und unter Stickstoff getrocknet, in 150 &mgr;l Methanol:Dichlorethan (75:25, Volumen:Volumen) wieder aufgelöst und ein Aliquot von 1 &mgr;l wurde in das UPLC ® -System injiziert.

Serumproben (0,5 ml) wurden zur Retinol- und RE-Bestimmung in Teströhrchen aliquotiert; Das 1,25-fache Volumen Ethanol wurde zu denaturierten Proteinen zugegeben. Der interne Standard war C23-β-apo-Carotinol. Die Proben wurden dreimal mit 0,75 ml Hexanen extrahiert; die überstehenden Fraktionen wurden gepoolt und unter Stickstoff getrocknet und in 100 &mgr;l Methanol:Dichlorethan (75:25, Volumen:Volumen) rekonstituiert. Zwei ul wurden unter den unten beschriebenen Bedingungen in den UPLC® injiziert. Serum-C-reaktives Protein (CRP) und Alpha1-Säure-Glycoprotein (AGP) wurden analysiert, um die Entzündung unter Verwendung von ELISA-Kits (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam) zu bewerten. Lycopin- und Alpha- und Beta-Carotin-Konzentrationen wurden durch routinemäßige HPLC-Analyse bestimmt.

Ultra-High Performance Liquid Chromatograph (UPLC)-Methode Eine Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard-Vorsäule wurde in Verbindung mit einer Waters Acquity UPLC® HSS C18-Säule (1,8 µm, 2,1 x 150 mm) verwendet. Das Verfahren verwendete zwei Lösungsmittelmischungen, die für einen 29-Minuten-Gradienten programmiert waren. Lösungsmittel A war Acetonitril-Wasser-Isopropanol (70:25:5, Volumen:Volumen:Volumen) mit 10 mmol/l Ammoniumacetat und Lösungsmittel B war Methanol-Isopropanol (75:25, Volumen:Volumen). Die Säulentemperatur wurde auf 32°C eingestellt und die Flussrate war 0,4 ml/min. Der Gradient begann mit 7 min Halten von 100 % Lösungsmittel A, gefolgt von einem 4-minütigen linearen Übergang zu 5 % A und einem weiteren Übergang zu 1 % A über 12 min. Der Lösungsmittelgradient wurde dann in 2 min auf 100 % A umgedreht und für 4 min äquilibriert. Chromatogramme wurden bei 311 nm für α-Retinol und α-REs, 325 nm für Retinol und REs und 450 nm für Carotinoide erzeugt. Alpha-REs, die fast ausschließlich aus Beta-Carotin in der Nahrung stammen, wurden als Proxy für die langfristige pflanzliche Exposition quantifiziert. Die Konzentrationen wurden unter Verwendung von Standardkurven berechnet, die von authentischen HPLC-gereinigten Standards von α-Retinol und Retinol abgeleitet wurden.