Reservas hepáticas de vitamina A e marcadores séricos de vitamina A em adultos dos EUA no momento da morte

Existem dados humanos mínimos sobre a vitamina A hepática real em comparação com biomarcadores sanguíneos. Um biomarcador sanguíneo, a porcentagem de retinol sérico total (vitamina A) na forma de ésteres de retinil, foi sugerido para diagnosticar hipervitaminose A com pontos de corte de 5% e 10%. Neste estudo, os investigadores pretendem comparar as reservas totais de vitamina A no fígado com a porcentagem total de retinol sérico como ésteres de retinil para avaliar a hipervitaminose A usando amostras de autópsia de adultos nos Estados Unidos. Os investigadores também avaliam a sensibilidade (capacidade do biomarcador de identificar corretamente aqueles com deficiência) e especificidade (capacidade do biomarcador de identificar corretamente aqueles sem deficiência) do retinol sérico para determinar deficiência de vitamina A, variação da concentração hepática de vitamina A entre os lobos , e concentrações de éster alfa-retinílico no fígado, um produto da clivagem do alfa-caroteno, um precursor da vitamina A.

Para conduzir o estudo, amostras de soro e fígado correspondentes foram obtidas de 27 cadáveres adultos dos EUA (de doadores com idade de 49 a 101 anos) e seus biomarcadores de vitamina A foram analisados. Amostras pareadas de fígado humano e soro foram coletadas de 27 cadáveres, 13 homens e 14 mulheres, e adquiridas como uma amostra consecutiva por meio de solicitação ao serviço National Disease Research Interchange. Resumos de história clínica não identificados também foram obtidos. Os critérios do doador foram os seguintes: sem restrições de raça ou sexo, sem história de quimioterapia e/ou radiação, sem história de intubação endotraqueal prolongada ou ventilação, sem evidência de sepse ou doença infecciosa (painel sorológico negativo) e faixas etárias de 21 anos -54 anos, 55-74 anos e >75 anos (a coleta alvo foi de 5 doadores do sexo masculino e 5 doadores do sexo feminino por faixa etária para fornecer uma amostra não homogênea). Depois que 10 indivíduos foram adquiridos em cada faixa etária (ou seja, 55-74 anos e >75 anos), as amostras não foram mais solicitadas. Todos os tecidos e soros foram colhidos dentro de 16 h post-mortem de setembro de 2013 a agosto de 2016. Os números do protocolo de aquisição foram DWEN1 002 022, 002 023 e 002 024 para fígado congelado, fígado embutido e soro, respectivamente. As amostras de soro foram isoladas por separação em gel e congeladas; amostras primárias de fígado foram congeladas em N2 líquido; uma segunda amostra de fígado de cada doador foi incorporada em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congelada rapidamente em um molde criogênico. Dois fígados foram adquiridos quase inteiros e avaliados quanto à distribuição de VA dentro e entre os lobos. As amostras foram enviadas em gelo seco para Madison, WI, e armazenadas em um freezer a -80°C.

Amostras de fígado embebidas em OCT foram preparadas como seções congeladas de 5 µm usando um criostato e coradas usando hematoxilina e eosina de rotina e protocolos e reagentes tricrômicos de Masson (Newcomer Supply, Middleton, WI). As imagens foram capturadas usando um microscópio de campo claro Nikon E-600 (Melville, NY) e uma câmera de microscopia digital Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Amostras de fígado (1 g) para análises de VA e carotenóides foram pesadas e depois moídas com sulfato de sódio (4-5 g) em um almofariz e pilão usando métodos publicados com pequenas modificações. O beta-apo-carotenol C-23 purificado foi adicionado para determinar as eficiências de extração. As amostras foram extraídas repetidamente com diclorometano e filtradas através de WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) em frascos volumétricos de 50 mL. Uma alíquota (5 mL) foi seca sob nitrogênio, redissolvida em 300 µL de metanol:dicloroetano (75:25, volume:volume) e uma alíquota de 1 µL foi injetada em um cromatógrafo líquido de ultrapressão Waters Acquity H-Class ( UPLC®) equipado com um detector de arranjo de fotodiodos (Milford, MA). As alíquotas foram ainda saponificadas para quantificação do alfa-retinol total, conforme descrito abaixo para as análises do lóbulo. Para as avaliações das amostras de lobo do fígado, amostras de 1 g foram extraídas em triplicado de cada lobo disponível. Uma alíquota de 5 mL do extrato foi saponificada com 400 mL de hidróxido de potássio:água (50:50, peso:volume) a 45°C por 1 hora. A reação foi extinta com 0,5 mL de água e extraída três vezes com 0,5 mL de hexanos. As camadas de hexano foram reunidas e secas sob nitrogênio, redissolvidas em 150 µL de metanol:dicloroetano (75:25, volume:volume) e uma alíquota de 1 µL foi injetada no sistema UPLC®.

Amostras de soro (0,5 mL) foram aliquotadas em tubos de ensaio para determinação de retinol e RE; 1,25 X volume de etanol foi adicionado para desnaturar as proteínas. O padrão interno foi C23-β-apo-carotenol. As amostras foram extraídas três vezes com 0,75 mL de hexanos; as frações sobrenadantes foram reunidas e secas sob nitrogênio e reconstituídas em 100 µL de metanol:dicloroetano (75:25, volume:volume). Dois µL foram injetados no UPLC® nas condições descritas abaixo. A proteína C reativa (PCR) sérica e a glicoproteína ácida alfa-1 (AGP) foram analisadas para avaliar a inflamação usando kits ELISA (PCR: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). As concentrações de licopeno e alfa e beta-caroteno foram determinadas por análise de HPLC de rotina.

Método de cromatografia líquida de ultra alta performance (UPLC) Uma pré-coluna Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard foi usada em conjunto com uma coluna Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). O método utilizou duas misturas de solventes programadas para um gradiente de 29 min. O solvente A foi acetonitrila-água-isopropanol (70:25:5, volume:volume:volume) com 10 mmol/L de acetato de amônio e o solvente B foi metanol-isopropanol (75:25, volume:volume). A temperatura da coluna foi ajustada para 32°C e a taxa de fluxo foi de 0,4 mL/min. O gradiente começou mantendo 100% de solvente A por 7 min, seguido por uma transição linear de 4 min para 5% de A e outra transição para 1% de A ao longo de 12 min. O gradiente de solvente foi então revertido para 100% A em 2 min e equilibrado por 4 min. Os cromatogramas foram gerados em 311 nm para α-retinol e α-REs, 325 nm para retinol e REs e 450 nm para carotenóides. os alfa-REs, derivados quase exclusivamente do beta-caroteno na dieta, foram quantificados como um substituto para a exposição vegetal a longo prazo. As concentrações foram calculadas usando curvas padrão derivadas de padrões autênticos purificados por HPLC de α-retinol e retinol.