Запасы витамина А в печени и сывороточные маркеры витамина А у взрослых в США на момент смерти

Имеются минимальные человеческие данные о реальном витамине А в печени по сравнению с биомаркерами крови. Один биомаркер крови, процентное содержание общего ретинола в сыворотке (витамин А) в форме ретиниловых эфиров, был предложен для диагностики гипервитаминоза А с пороговыми значениями 5% и 10%. В этом исследовании исследователи стремятся сравнить общие запасы витамина А в печени с процентным содержанием общего ретинола в сыворотке в виде ретиниловых эфиров, чтобы оценить гипервитаминоз А с использованием образцов вскрытия взрослых людей из США. Исследователи также оценивают чувствительность (способность биомаркера правильно идентифицировать тех, у кого дефицит) и специфичность (способность биомаркера правильно идентифицировать тех, у кого нет дефицита) сывороточного ретинола для определения дефицита витамина А, вариации концентрации витамина А в печени между долями. , и концентрации альфа-ретинилового эфира печени, продукта расщепления альфа-каротина, предшественника витамина А.

Для проведения исследования были получены соответствующие образцы сыворотки и печени от 27 трупов взрослых в США (от доноров в возрасте 49-101 лет) и проанализированы их биомаркеры витамина А. Совпадающие образцы печени и сыворотки человека были собраны у 27 трупов, 13 мужчин и 14 женщин, и получены в качестве последовательных образцов по запросу в Национальную службу обмена исследованиями заболеваний. Были также получены деидентифицированные резюме истории болезни. Критерии донорства были следующими: отсутствие ограничений по расе или полу, отсутствие в анамнезе химиотерапии и/или облучения, отсутствие в анамнезе длительной эндотрахеальной интубации или вентиляции, отсутствие признаков сепсиса или инфекционного заболевания (отрицательная серологическая панель), возрастной диапазон от 21 года. -54 года, 55-74 года и >75 лет (целевая коллекция состояла из 5 доноров мужского и 5 женского пола в возрастном диапазоне для получения негомогенной выборки). После того, как было получено 10 человек в каждом возрастном диапазоне (т.е. 55-74 лет и >75 лет), образцы больше не запрашивались. Все ткани и сыворотки были получены в течение 16 часов после смерти с сентября 2013 г. по август 2016 г. Номера протоколов закупок были DWEN1 002 022, 002 023 и 002 024 для замороженной печени, встроенной печени и сыворотки соответственно. Образцы сыворотки выделяли с помощью разделения геля, а затем замораживали; первичные образцы печени быстро замораживали в жидком N2; второй образец печени от каждого донора был помещен в компаунд с оптимальной температурой разрезания (OCT) и мгновенно заморожен в криоформе. Две печени были получены почти целыми и оценены на предмет распределения VA внутри и между долями. Образцы были отправлены на сухом льду в Мэдисон, штат Висконсин, и хранились в морозильной камере при температуре -80°C.

Образцы печени, встроенные в ОКТ, готовили в виде замороженных срезов размером 5 мкм с использованием криостата и окрашивали с использованием обычных протоколов и реагентов гематоксилина и эозина и трихрома Массона (Newcomer Supply, Миддлтон, Висконсин). Изображения были получены с использованием светлопольного микроскопа Nikon E-600 (Мелвилл, штат Нью-Йорк) и цифровой камеры для микроскопии Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Образцы печени (1 г) для анализа ВА и каротиноидов взвешивали, а затем растирали с сульфатом натрия (4-5 г) в ступке пестиком по опубликованным методикам с небольшими изменениями. Для определения эффективности экстракции добавляли очищенный бета-апокаротинол C-23. Образцы многократно экстрагировали дихлорметаном и фильтровали через WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Питтсбург, Пенсильвания) в мерные колбы на 50 мл. Аликвоту (5 мл) высушивали в атмосфере азота, повторно растворяли в 300 мкл смеси метанол:дихлорэтан (75:25, объем:объем) и аликвоту объемом 1 мкл вводили в жидкостный хроматограф сверхвысокого давления Waters Acquity H-Class ( UPLC®), оснащенная матричным фотодиодным детектором (Милфорд, Массачусетс). Аликвоты дополнительно омыляли для количественного определения общего альфа-ретинола, как описано ниже для анализа доли. Для оценки образцов долей печени из каждой доступной доли извлекали образцы по 1 г в трех экземплярах. Аликвоту 5 мл экстракта омыляли 400 мл гидроксида калия:вода (50:50, масса:объем) при 45°С в течение 1 часа. Реакцию гасили 0,5 мл воды и трижды экстрагировали 0,5 мл гексана. Гексановые слои объединяли и сушили в атмосфере азота, повторно растворяли в смеси 150 мкл метанол:дихлорэтан (75:25, объем:объем) и аликвоту 1 мкл вводили в систему UPLC®.

Образцы сыворотки (0,5 мл) аликвотировали в пробирки для определения ретинола и РЭ; Для денатурации белков добавляли 1,25-кратный объем этанола. В качестве внутреннего стандарта использовали С23-β-апо-каротинол. Образцы трижды экстрагировали гексаном по 0,75 мл; супернатантные фракции объединяли, сушили в атмосфере азота и восстанавливали в смеси 100 мкл метанол:дихлорэтан (75:25, объем:объем). Два мкл вводили в UPLC® в условиях, описанных ниже. Сывороточный С-реактивный белок (CRP) и альфа-1-кислый гликопротеин (AGP) анализировали для оценки воспаления с использованием наборов ELISA (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Концентрации ликопина и альфа- и бета-каротина определяли рутинным анализом ВЭЖХ.

Метод сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) Предварительную колонку Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 мкм VanGuard использовали в сочетании с колонкой Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 мкм, 2,1 x 150 мм). В методе использовались две смеси растворителей, запрограммированные на 29-минутный градиент. Растворитель А представлял собой ацетонитрил-вода-изопропанол (70:25:5, объем:объем:объем) с 10 ммоль/л ацетата аммония, а растворитель В представлял собой метанол-изопропанол (75:25, объем:объем). Температуру колонки устанавливали на 32°С, а скорость потока составляла 0,4 мл/мин. Градиент начинался с выдерживания 100% растворителя А в течение 7 минут, после чего следовал 4-минутный линейный переход к 5% А и еще один переход к 1% А в течение 12 минут. Затем градиент растворителя реверсировали до 100% А за 2 мин и уравновешивали в течение 4 мин. Хроматограммы генерировали при 311 нм для α-ретинола и α-RE, 325 нм для ретинола и RE и 450 нм для каротиноидов. альфа-РЭ, полученные почти исключительно из бета-каротина в рационе, были количественно оценены как косвенный показатель долгосрочного воздействия овощей. Концентрации рассчитывали с использованием стандартных кривых, полученных из аутентичных очищенных ВЭЖХ стандартов α-ретинола и ретинола.