Réserves hépatiques de vitamine A et marqueurs sériques de la vitamine A chez les adultes américains au moment du décès

Des données humaines minimales existent sur la vitamine A hépatique réelle par rapport aux biomarqueurs sanguins. Un biomarqueur sanguin, le pourcentage de rétinol sérique total (vitamine A) sous forme d'esters de rétinyle, a été suggéré pour diagnostiquer l'hypervitaminose A avec des seuils de 5 % et 10 %. Dans cette étude, les chercheurs visent à comparer les réserves totales de vitamine A du foie avec le pourcentage de rétinol sérique total sous forme d'esters de rétinyle pour évaluer l'hypervitaminose A à l'aide d'échantillons d'autopsie d'adultes américains. Les enquêteurs évaluent également la sensibilité (la capacité du biomarqueur à identifier correctement les personnes présentant une déficience) et la spécificité (la capacité du biomarqueur à identifier correctement les personnes sans déficience) du rétinol sérique pour déterminer la carence en vitamine A, la variation de la concentration hépatique en vitamine A entre les lobes , et les concentrations d'ester alpha rétinylique dans le foie, un produit de clivage de l'alpha-carotène, un précurseur de la vitamine A.

Pour mener l'étude, des échantillons de sérum et de foie appariés ont été prélevés sur 27 cadavres adultes américains (de donneurs âgés de 49 à 101 ans) et leurs biomarqueurs de vitamine A ont été analysés. Des échantillons de foie et de sérum humains appariés ont été prélevés sur 27 cadavres, 13 hommes et 14 femmes, et acquis en tant qu'échantillon consécutif par le biais d'une demande adressée au service National Disease Research Interchange. Des résumés d'antécédents cliniques anonymisés ont également été obtenus. Les critères du donneur étaient les suivants : aucune restriction de race ou de sexe, aucun antécédent de chimiothérapie et/ou de radiothérapie, aucun antécédent d'intubation ou de ventilation endotrachéale prolongée, aucun signe de septicémie ou de maladie infectieuse (panel sérologique négatif) et des tranches d'âge de 21 ans -54 ans, 55-74 ans et >75 ans (la collecte cible était de 5 donneurs masculins et 5 donneurs féminins par tranche d'âge pour fournir un échantillon non homogène). Une fois que 10 personnes ont été acquises dans chaque tranche d'âge (c.-à-d. 55-74 ans et > 75 ans), les échantillons n'étaient plus demandés. Tous les tissus et sérums ont été obtenus dans les 16 heures post-mortem de septembre 2013 à août 2016. Les numéros de protocole d'approvisionnement étaient DWEN1 002 022, 002 023 et 002 024 pour le foie congelé, le foie inclus et le sérum, respectivement. Des échantillons de sérum ont été isolés par séparation sur gel puis congelés ; les échantillons primaires de foie ont été congelés instantanément dans du N2 liquide ; un deuxième échantillon de foie de chaque donneur a été intégré dans un composé à température de coupe optimale (OCT) et congelé instantanément dans un cryomoule. Deux foies ont été achetés presque entiers et évalués pour la distribution VA dans et entre les lobes. Les échantillons ont été expédiés sur de la neige carbonique à Madison, WI, et stockés dans un congélateur à -80°C.

Des échantillons de foie inclus dans l'OCT ont été préparés sous forme de sections congelées de 5 µm à l'aide d'un cryostat et colorés à l'aide des protocoles et réactifs de routine à l'hématoxyline et à l'éosine et au trichrome de Masson (Newcomer Supply, Middleton, WI). Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope à champ clair Nikon E-600 (Melville, NY) et d'une caméra de microscopie numérique Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Des échantillons de foie (1 g) pour les analyses VA et caroténoïdes ont été pesés puis broyés avec du sulfate de sodium (4-5 g) dans un mortier et un pilon en utilisant des méthodes publiées avec des modifications mineures. Du bêta-apo-caroténol C-23 purifié a été ajouté pour déterminer les efficacités d'extraction. Les échantillons ont été extraits à plusieurs reprises avec du dichlorométhane et filtrés à travers WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) dans des flacons volumétriques de 50 ml. Une aliquote (5 mL) a été séchée sous azote, redissoute dans 300 µL de méthanol:dichloroéthane (75:25, volume:volume) et une aliquote de 1 µL a été injectée dans un chromatographe liquide à ultra-pression Waters Acquity H-Class ( UPLC®) équipé d'un détecteur à barrette de photodiodes (Milford, MA). Des aliquotes ont ensuite été saponifiées pour la quantification de l'alpha-rétinol total comme décrit ci-dessous pour les analyses de lobe. Pour les évaluations des échantillons de lobe du foie, des échantillons de 1 g ont été extraits en triple de chaque lobe disponible. Une aliquote de 5 ml de l'extrait a été saponifiée avec 400 ml d'hydroxyde de potassium:eau (50:50, poids:volume) à 45°C pendant 1 h. La réaction a été stoppée avec 0,5 ml d'eau et extraite trois fois avec 0,5 ml d'hexanes. Les couches d'hexane ont été regroupées et séchées sous azote, redissoutes dans 150 µL de méthanol:dichloroéthane (75:25, volume:volume) et une aliquote de 1 µL a été injectée dans le système UPLC®.

Des échantillons de sérum (0,5 ml) ont été aliquotés dans des tubes à essai pour la détermination du rétinol et du RE ; 1,25 X volume d'éthanol a été ajouté pour dénaturer les protéines. L'étalon interne était le C23-β-apo-caroténol. Les échantillons ont été extraits trois fois avec 0,75 mL d'hexanes ; les fractions surnageantes ont été regroupées et séchées sous azote et reconstituées dans 100 µL de méthanol : dichloroéthane (75:25, volume:volume). Deux µL ont été injectés dans l'UPLC® dans les conditions décrites ci-dessous. La protéine C-réactive sérique (CRP) et la glycoprotéine acide alpha1 (AGP) ont été analysées pour évaluer l'inflammation à l'aide de kits ELISA (CRP : Cayman Chemical Company ; AGP : Abcam). Les concentrations de lycopène et d'alpha et de bêta-carotène ont été déterminées par une analyse HPLC de routine.

Méthode de chromatographie liquide à ultra haute performance (UPLC) Une pré-colonne Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard a été utilisée conjointement avec une colonne Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). La méthode utilisait deux mélanges de solvants programmés pour un gradient de 29 minutes. Le solvant A était l'acétonitrile-eau-isopropanol (70:25:5, volume:volume:volume) avec 10 mmol/L d'acétate d'ammonium et le solvant B était le méthanol-isopropanol (75:25, volume:volume). La température de la colonne a été fixée à 32°C et le débit était de 0,4 ml/min. Le gradient a commencé par maintenir 100 % de solvant A pendant 7 min, suivi d'une transition linéaire de 4 min vers 5 % A et d'une autre transition vers 1 % A pendant 12 min. Le gradient de solvant a ensuite été inversé à 100 % A en 2 min et équilibré pendant 4 min. Des chromatogrammes ont été générés à 311 nm pour l'α-rétinol et les α-RE, à 325 nm pour le rétinol et les ER et à 450 nm pour les caroténoïdes. Les alpha-ER, dérivés presque exclusivement du bêta-carotène dans l'alimentation, ont été quantifiés comme indicateur de l'exposition végétale à long terme. Les concentrations ont été calculées à l'aide de courbes étalons dérivées d'étalons authentiques purifiés par HPLC d'α-rétinol et de rétinol.