Vitamin A-leverreserver og serummarkører for vitamin A hos voksne i USA på dødstidspunktet

Der findes minimale humane data om faktiske A-vitamin i leveren sammenlignet med blodbiomarkører. En blodbiomarkør, procentdelen af ​​total serumretinol (vitamin A) i form af retinylestere, er blevet foreslået til at diagnosticere hypervitaminose A med cutoffs på 5 % og 10 %. I denne undersøgelse sigter efterforskerne på at sammenligne de samlede A-vitaminreserver i leveren med den samlede procentdel af serumretinol som retinylestere for at evaluere hypervitaminose A ved hjælp af obduktionsprøver fra amerikanske voksne. Efterforskere evaluerer også sensitiviteten (biomarkørens evne til korrekt at identificere dem med mangel) og specificiteten (biomarkørens evne til korrekt at identificere dem uden mangel) af serumretinol for at bestemme vitamin A-mangel, variation i leverens vitamin A-koncentration blandt lapper , og lever alpha retinyl ester koncentrationer, et spaltningsprodukt af alpha-caroten, en vitamin A precursor.

For at udføre undersøgelsen blev matchede serum- og leverprøver udtaget fra 27 amerikanske voksne kadavere (fra donorer i alderen 49-101 år), og deres vitamin A-biomarkører blev analyseret. Matchende humane lever- og serumprøver blev indsamlet fra 27 kadavere, 13 mænd og 14 kvinder, og erhvervet som en fortløbende prøve gennem en anmodning til National Disease Research Interchange-tjenesten. De-identificerede kliniske historieresuméer blev også opnået. Donorkriterierne var som følger: ingen restriktioner på race eller køn, ingen historie med kemoterapi og/eller stråling, ingen historie med forlænget endotracheal intubation eller ventilation, ingen tegn på sepsis eller infektionssygdom (negativt serologisk panel) og aldersgrupper på 21 -54 år, 55-74 år og >75 år (målindsamlingen var 5 mandlige og 5 kvindelige donorer pr. aldersgruppe for at give en ikke-homogen prøve). Efter at 10 individer blev erhvervet i hver aldersgruppe (dvs. 55-74 år og >75 år), blev der ikke længere anmodet om prøver. Alt væv og sera blev udtaget inden for 16 timer post mortem fra september 2013 til august 2016. Indkøbsprotokolnumrene var DWEN1 002 022, 002 023 og 002 024 for henholdsvis frossen lever, indlejret lever og serum. Serumprøver blev isoleret via gelseparation og derefter frosset; primære leverprøver blev lynfrosset i flydende N2; en anden leverprøve fra hver donor blev indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) og lynfrosset i en kryomold. To lever blev udtaget næsten hele og evalueret for VA-fordeling inden for og blandt lapper. Prøver blev sendt på tøris til Madison, WI, og opbevaret i en -80°C fryser.

OCT-indlejrede leverprøver blev fremstillet som 5 µm frosne sektioner ved anvendelse af en kryostat og farvet ved hjælp af rutinemæssig hæmatoxylin og eosin og Massons trichrom-protokoller og reagenser (Newcomer Supply, Middleton, WI). Billeder blev optaget ved hjælp af et Nikon E-600 lysfeltmikroskop (Melville, NY) og Olympus DP-71 digitalt mikroskopikamera (Center Valley, PA). Leverprøver (1 g) til VA- og carotenoidanalyser blev vejet og derefter malet med natriumsulfat (4-5 g) i en morter og støder under anvendelse af offentliggjorte metoder med mindre modifikationer. Oprenset C-23 beta-apo-carotenol blev tilsat for at bestemme ekstraktionseffektiviteten. Prøver blev ekstraheret gentagne gange med dichlormethan og filtreret gennem WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) i 50 ml målekolber. En alikvot (5 ml) blev tørret under nitrogen, genopløst i 300 µL methanol:dichlorethan (75:25, volumen:volumen), og en alikvot på 1 µL blev injiceret i en Waters Acquity H-Class ultratryk væskekromatograf ( UPLC®)-system udstyret med en fotodiodearraydetektor (Milford, MA). Alikvoter blev yderligere forsæbet til kvantificering af total alpha-retinol som beskrevet nedenfor for lapanalyserne. Til leverlapsprøveevalueringer blev 1 g prøver ekstraheret i tre eksemplarer fra hver tilgængelig lap. En 5 ml alikvot af ekstraktet blev forsæbet med 400 ml kaliumhydroxid:vand (50:50, vægt:volumen) ved 45°C i 1 time. Reaktionen blev standset med 0,5 ml vand og ekstraheret tre gange med 0,5 ml hexaner. Hexanlagene blev samlet og tørret under nitrogen, genopløst i 150 µl methanol:dichlorethan (75:25, volumen:volumen), og en alikvot på 1 µl blev injiceret i UPLC®-systemet.

Serumprøver (0,5 ml) blev fordelt i reagensglas til retinol- og RE-bestemmelse; 1,25 X volumen ethanol blev tilsat for at denaturere proteiner. Den interne standard var C23-β-apo-carotenol. Prøver blev ekstraheret tre gange med 0,75 ml hexaner; supernatantfraktionerne blev samlet og tørret under nitrogen og rekonstitueret i 100 µl methanol:dichlorethan (75:25, volumen:volumen). To µl blev injiceret i UPLC® under betingelserne beskrevet nedenfor. Serum C-reaktivt protein (CRP) og alfa1-syreglycoprotein (AGP) blev analyseret for at evaluere inflammation ved hjælp af ELISA-sæt (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Lycopen- og alfa- og beta-carotenkoncentrationer blev bestemt ved rutinemæssig HPLC-analyse.

Ultrahøj ydeevne væskekromatograf-metode (UPLC) En Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard-prækolonne blev brugt sammen med en Waters Acquity UPLC® HSS C18-søjle (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). Metoden anvendte to opløsningsmiddelblandinger programmeret til en 29-minutters gradient. Opløsningsmiddel A var acetonitril-vand-isopropanol (70:25:5, volumen:volumen:volumen) med 10 mmol/L ammoniumacetat, og opløsningsmiddel B var methanol-isopropanol (75:25, volumen:volumen). Søjletemperaturen blev indstillet til 32°C, og strømningshastigheden var 0,4 ml/min. Gradienten begyndte med at holde 100 % opløsningsmiddel A i 7 minutter, efterfulgt af en 4-minutters lineær overgang til 5 % A og en anden overgang til 1 % A over 12 minutter. Opløsningsmiddelgradienten blev derefter vendt til 100 % A i 2 minutter og ækvilibreret i 4 minutter. Kromatogrammer blev genereret ved 311 nm for α-retinol og α-REs, 325 nm for retinol og REs og 450 nm for carotenoider. alpha-RE'er, der næsten udelukkende stammer fra beta-caroten i kosten, blev kvantificeret som en proxy for langvarig eksponering for grøntsager. Koncentrationerne blev beregnet under anvendelse af standardkurver afledt af autentiske HPLC-oprensede standarder af a-retinol og retinol.