Vitamin A-leverreserver og serummarkører for vitamin A hos amerikanske voksne ved dødstidspunktet

Det finnes minimale menneskelige data om faktisk levervitamin A sammenlignet med biomarkører i blod. En blodbiomarkør, prosentandelen av totalt serumretinol (vitamin A) i form av retinylestere, har blitt foreslått for å diagnostisere hypervitaminose A med grenseverdier på 5 % og 10 %. I denne studien tar etterforskerne sikte på å sammenligne totale vitamin A-reserver i leveren med prosentandelen totalt serumretinol som retinylestere for å evaluere hypervitaminose A ved å bruke obduksjonsprøver fra amerikanske voksne. Etterforskere evaluerer også sensitiviteten (evnen til biomarkøren til å identifisere de med mangel) og spesifisiteten (evnen til biomarkøren til å identifisere de uten mangel) av serumretinol for å bestemme vitamin A-mangel, variasjon i leverens vitamin A-konsentrasjon blant lapper. , og lever alfa retinyl ester konsentrasjoner, et spaltningsprodukt av alfa-karoten, en vitamin A forløper.

For å gjennomføre studien ble matchende serum- og leverprøver hentet fra 27 amerikanske voksne kadavere (fra donorer i alderen 49-101 år) og deres vitamin A-biomarkører ble analysert. Matchende humane lever- og serumprøver ble samlet inn fra 27 kadaver, 13 menn og 14 kvinner, og innhentet som en påfølgende prøve gjennom en forespørsel til National Disease Research Interchange-tjenesten. Avidentifiserte sammendrag av klinisk historie ble også innhentet. Donorkriteriene var som følger: ingen restriksjoner på rase eller kjønn, ingen historie med kjemoterapi og/eller stråling, ingen historie med forlenget endotrakeal intubasjon eller ventilasjon, ingen tegn på sepsis eller infeksjonssykdom (negativt serologisk panel) og aldersgrupper på 21 -54 år, 55-74 år og >75 år (målsamlingen var 5 mannlige og 5 kvinnelige donorer per aldersgruppe for å gi en ikke-homogen prøve). Etter at 10 individer ble anskaffet i hver aldersgruppe (dvs. 55-74 år og >75 år), ble det ikke lenger forespurt om prøver. Alt vev og sera ble anskaffet innen 16 timer post mortem fra september 2013 til august 2016. Anskaffelsesprotokollnumrene var DWEN1 002 022, 002 023 og 002 024 for henholdsvis frossen lever, innebygd lever og serum. Serumprøver ble isolert via gelseparasjon og deretter frosset; primære leverprøver ble hurtigfrosset i flytende N2; en andre leverprøve fra hver donor ble innebygd i optimal kuttetemperaturforbindelse (OCT) og hurtigfryst i en kryomold. To lever ble skaffet nesten hele og evaluert for VA-fordeling i og blant lapper. Prøver ble sendt på tørris til Madison, WI, og lagret i en -80°C fryser.

OCT-innebygde leverprøver ble fremstilt som 5 µm frosne seksjoner ved bruk av en kryostat og farget ved bruk av rutinemessig hematoksylin og eosin og Massons trikromprotokoller og reagenser (Newcomer Supply, Middleton, WI). Bildene ble tatt med et Nikon E-600 lysfeltmikroskop (Melville, NY) og Olympus DP-71 digitalt mikroskopikamera (Center Valley, PA). Leverprøver (1 g) for VA- og karotenoidanalyser ble veid og deretter malt med natriumsulfat (4-5 g) i en morter og stamper ved bruk av publiserte metoder med mindre modifikasjoner. Renset C-23 beta-apo-karotenol ble tilsatt for å bestemme ekstraksjonseffektiviteten. Prøver ble ekstrahert gjentatte ganger med diklormetan og filtrert gjennom WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) inn i 50 ml målekolber. En alikvot (5 mL) ble tørket under nitrogen, oppløst på nytt i 300 μL metanol:dikloretan (75:25, volum:volum) og en alikvot på 1 μL ble injisert i en Waters Acquity H-Class ultratrykk væskekromatograf ( UPLC®)-system utstyrt med en fotodiodearraydetektor (Milford, MA). Alikvoter ble ytterligere forsåpet for kvantifisering av total alfa-retinol som beskrevet nedenfor for lobeanalysene. For leverlappprøveevalueringer ble 1 g prøver ekstrahert i tre eksemplarer fra hver tilgjengelig lapp. En 5 ml alikvot av ekstraktet ble forsåpet med 400 ml kaliumhydroksid:vann (50:50, vekt:volum) ved 45°C i 1 time. Reaksjonen ble stoppet med 0,5 ml vann og ekstrahert tre ganger med 0,5 ml heksaner. Heksanlagene ble slått sammen og tørket under nitrogen, gjenoppløst i 150 µL metanol:dikloretan (75:25, volum:volum), og en alikvot på 1 µL ble injisert i UPLC®-systemet.

Serumprøver (0,5 ml) ble fordelt i prøverør for retinol- og RE-bestemmelse; 1,25 X volum etanol ble tilsatt for å denaturere proteiner. Den interne standarden var C23-β-apo-karotenol. Prøver ble ekstrahert tre ganger med 0,75 ml heksaner; supernatantfraksjonene ble slått sammen og tørket under nitrogen og rekonstituert i 100 ul metanol:dikloretan (75:25, volum:volum). To ul ble injisert i UPLC® under betingelsene beskrevet nedenfor. Serum C-reaktivt protein (CRP) og alfa1-syreglykoprotein (AGP) ble analysert for å evaluere betennelse ved bruk av ELISA-sett (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Lykopen og alfa- og betakarotenkonsentrasjoner ble bestemt ved rutinemessig HPLC-analyse.

Ultra-high Performance Liquid Chromatograph (UPLC) metode En Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard pre-kolonne ble brukt sammen med en Waters Acquity UPLC® HSS C18 kolonne (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). Metoden brukte to løsemiddelblandinger programmert for en 29-minutters gradient. Løsningsmiddel A var acetonitril-vann-isopropanol (70:25:5, volum:volum:volum) med 10 mmol/L ammoniumacetat og løsningsmiddel B var metanol-isopropanol (75:25, volum:volum). Kolonnetemperaturen ble satt til 32°C og strømningshastigheten var 0,4 ml/min. Gradienten begynte med å holde 100 % løsemiddel A i 7 minutter, etterfulgt av en 4-minutters lineær overgang til 5 % A, og en annen overgang til 1 % A over 12 minutter. Løsningsmiddelgradienten ble deretter reversert til 100 % A på 2 minutter og ekvilibrert i 4 minutter. Kromatogrammer ble generert ved 311 nm for α-retinol og α-REs, 325 nm for retinol og REs, og 450 nm for karotenoider. alfa-RE, avledet nesten utelukkende fra betakaroten i kosten, ble kvantifisert som en proxy for langvarig eksponering for grønnsaker. Konsentrasjonene ble beregnet ved å bruke standardkurver avledet fra autentiske HPLC-rensede standarder av a-retinol og retinol.