Rezerwy witaminy A w wątrobie i markery surowicy witaminy A u dorosłych w USA w chwili śmierci

Istnieją minimalne dane dotyczące ludzi na temat rzeczywistej witaminy A w wątrobie w porównaniu z biomarkerami krwi. Sugeruje się, że jeden biomarker krwi, procent całkowitego retinolu w surowicy (witaminy A) w postaci estrów retinylu, służy do diagnozowania hiperwitaminozy A z wartościami odcięcia 5% i 10%. W tym badaniu badacze mają na celu porównanie całkowitych rezerw witaminy A w wątrobie z procentem całkowitego retinolu w surowicy jako estrów retinylu w celu oceny hiperwitaminozy A przy użyciu próbek pobranych z autopsji od dorosłych Amerykanów. Badacze oceniają również czułość (zdolność biomarkera do prawidłowej identyfikacji osób z niedoborem) i swoistość (zdolność biomarkera do prawidłowej identyfikacji osób bez niedoboru) retinolu w surowicy w celu określenia niedoboru witaminy A, zmienności stężenia witaminy A w wątrobie między płatami oraz stężenia estrów alfa retinylu w wątrobie, produktu rozkładu alfa-karotenu, prekursora witaminy A.

Aby przeprowadzić badanie, pobrano dopasowane próbki surowicy i wątroby od 27 dorosłych zwłok z USA (od dawców w wieku 49-101 lat) i przeanalizowano ich biomarkery witaminy A. Dopasowane próbki ludzkiej wątroby i surowicy pobrano od 27 zwłok, 13 mężczyzn i 14 kobiet, i uzyskano jako kolejną próbkę za pośrednictwem usługi National Disease Research Interchange. Uzyskano również anonimowe podsumowania historii klinicznej. Kryteria dawców były następujące: brak ograniczeń rasowych lub płciowych, brak historii chemioterapii i/lub radioterapii, brak historii przedłużonej intubacji lub wentylacji dotchawiczej, brak dowodów na posocznicę lub chorobę zakaźną (negatywny panel serologiczny) i przedziały wiekowe 21 -54 lata, 55-74 lata i >75 lat (docelowa zbiórka obejmowała 5 mężczyzn i 5 kobiet dawców z każdego przedziału wiekowego, aby zapewnić niejednorodną próbkę). Po pozyskaniu 10 osobników w każdym przedziale wiekowym (tj. 55-74 lat i >75 lat) nie żądano już próbek. Wszystkie tkanki i surowice pobrano w ciągu 16 godzin pośmiertnie od września 2013 do sierpnia 2016. Numery protokołów pobrania to DWEN1 002 022, 002 023 i 002 024 odpowiednio dla zamrożonej wątroby, zatopionej wątroby i surowicy. Próbki surowicy wyizolowano przez separację żelową, a następnie zamrożono; pierwotne próbki wątroby szybko zamrożono w ciekłym N2; drugą próbkę wątroby od każdego dawcy zatopiono w mieszance o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i szybko zamrożono w krioformie. Pobrano dwie wątroby prawie w całości i oceniono pod kątem rozmieszczenia VA w płatach i między nimi. Próbki wysłano na suchym lodzie do Madison, WI i przechowywano w zamrażarce -80°C.

Próbki wątroby zatopione w OCT przygotowano jako 5-µm zamrożone skrawki przy użyciu kriostatu i wybarwiono przy użyciu rutynowych protokołów i odczynników hematoksyliny i eozyny oraz trichromu Massona (Newcomer Supply, Middleton, WI). Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu jasnego pola Nikon E-600 (Melville, NY) i cyfrowego aparatu mikroskopowego Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Próbki wątroby (1 g) do analizy VA i karotenoidów zważono, a następnie zmielono z siarczanem sodu (4-5 g) w moździerzu i tłuczku, stosując opublikowane metody z niewielkimi modyfikacjami. Oczyszczony C-23 beta-apo-karotenol dodano w celu określenia wydajności ekstrakcji. Próbki wielokrotnie ekstrahowano dichlorometanem i przesączono przez WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) do kolb miarowych o pojemności 50 ml. Porcję (5 ml) wysuszono w atmosferze azotu, ponownie rozpuszczono w 300 µl metanolu:dichloroetanie (75:25, objętość:objętość) i porcję 1 µl wstrzyknięto do ultraciśnieniowego chromatografu cieczowego Waters Acquity H-Class ( UPLC®) wyposażony w detektor z matrycą fotodiod (Milford, MA). Porcje dalej zmydlano w celu ilościowego oznaczenia całkowitego alfa-retinolu, jak opisano poniżej dla analiz płatków. Do oceny próbek płatów wątroby, próbki 1 g ekstrahowano w trzech powtórzeniach z każdego dostępnego płata. 5-ml porcję ekstraktu zmydlano za pomocą 400 ml wodorotlenku potasu:wody (50:50, masa:objętość) w 45°C przez 1 godzinę. Reakcję zatrzymano 0,5 ml wody i trzykrotnie ekstrahowano 0,5 ml heksanów. Warstwy heksanowe połączono i wysuszono w atmosferze azotu, ponownie rozpuszczono w 150 µl metanolu:dichloroetanu (75:25, objętość:objętość) i porcję 1 µl wstrzyknięto do układu UPLC®.

Próbki surowicy (0,5 ml) podzielono na porcje do probówek testowych w celu oznaczenia retinolu i RE; W celu zdenaturowania białek dodano 1,25 X objętości etanolu. Standardem wewnętrznym był C23-β-apo-karotenol. Próbki ekstrahowano trzykrotnie 0,75 ml heksanów; frakcje supernatantu połączono, wysuszono w atmosferze azotu i rozpuszczono w 100 ul metanolu:dichloroetanu (75:25, objętość:objętość). Dwa µl wstrzyknięto do UPLC® w warunkach opisanych poniżej. Białko C-reaktywne (CRP) w surowicy i kwaśną glikoproteinę alfa1 (AGP) analizowano w celu oceny stanu zapalnego przy użyciu zestawów ELISA (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Stężenia likopenu oraz alfa- i beta-karotenu określono za pomocą rutynowej analizy HPLC.

Metoda ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) Wstępną kolumnę Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 urn VanGuard zastosowano w połączeniu z kolumną Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 urn, 2,1 x 150 mm). W metodzie wykorzystano dwie mieszanki rozpuszczalników zaprogramowane na 29-minutowy gradient. Rozpuszczalnikiem A był acetonitryl-woda-izopropanol (70:25:5, objętość:objętość:objętość) z 10 mmol/l octanu amonu, a rozpuszczalnikiem B był metanol-izopropanol (75:25, objętość:objętość). Temperaturę kolumny ustawiono na 32°C, a szybkość przepływu wynosiła 0,4 ml/min. Gradient rozpoczął się od utrzymywania 100% rozpuszczalnika A przez 7 minut, po czym następowało 4-minutowe liniowe przejście do 5% A i kolejne przejście do 1% A przez 12 minut. Gradient rozpuszczalnika następnie odwrócono do 100% A w ciągu 2 minut i zrównoważono przez 4 minuty. Chromatogramy generowano przy 311 nm dla α-retinolu i α-RE, 325 nm dla retinolu i RE oraz 450 nm dla karotenoidów. alfa-RE, pochodzące prawie wyłącznie z beta-karotenu w diecie, zostały określone ilościowo jako przybliżenie długoterminowej ekspozycji na warzywa. Stężenia obliczono przy użyciu krzywych wzorcowych uzyskanych z autentycznych wzorców α-retinolu i retinolu oczyszczonych metodą HPLC.