Reservas hepáticas de vitamina A y marcadores séricos de vitamina A en adultos estadounidenses en el momento de la muerte

Existen datos mínimos en humanos sobre la vitamina A hepática real en comparación con los biomarcadores sanguíneos. Se ha sugerido un biomarcador sanguíneo, el porcentaje de retinol sérico total (vitamina A) en forma de ésteres de retinilo, para diagnosticar la hipervitaminosis A con puntos de corte del 5 % y el 10 %. En este estudio, los investigadores pretenden comparar las reservas totales de vitamina A en el hígado con el porcentaje de retinol sérico total como ésteres de retinilo para evaluar la hipervitaminosis A usando muestras de autopsia de adultos estadounidenses. Los investigadores también evalúan la sensibilidad (la capacidad del biomarcador para identificar correctamente a las personas con deficiencia) y la especificidad (la capacidad del biomarcador para identificar correctamente a las personas sin deficiencia) del retinol sérico para determinar la deficiencia de vitamina A, la variación de la concentración de vitamina A en el hígado entre los lóbulos , y las concentraciones de éster alfa retinilo en el hígado, un producto de escisión del alfacaroteno, un precursor de la vitamina A.

Para realizar el estudio, se obtuvieron muestras de suero e hígado compatibles de 27 cadáveres adultos de EE. UU. (de donantes de 49 a 101 años de edad) y se analizaron sus biomarcadores de vitamina A. Se recolectaron muestras de hígado y suero humanos emparejados de 27 cadáveres, 13 masculinos y 14 femeninos, y se adquirieron como una muestra consecutiva a través de una solicitud al Servicio Nacional de Intercambio de Investigación de Enfermedades. También se obtuvieron resúmenes de historias clínicas anonimizadas. Los criterios de donante fueron los siguientes: sin restricciones de raza o sexo, sin antecedentes de quimioterapia y/o radiación, sin antecedentes de intubación endotraqueal prolongada o ventilación, sin evidencia de sepsis o enfermedad infecciosa (panel serológico negativo) y rangos de edad de 21 años. -54 años, 55-74 años y >75 años (la recolección objetivo fue de 5 donantes masculinos y 5 femeninos por rango de edad para proporcionar una muestra no homogénea). Después de que se adquirieron 10 individuos en cada rango de edad (es decir, 55-74 años y >75 años), ya no se solicitaron muestras. Todos los tejidos y sueros se obtuvieron dentro de las 16 h post-mortem desde septiembre de 2013 hasta agosto de 2016. Los números de protocolo de adquisición fueron DWEN1 002 022, 002 023 y 002 024 para hígado congelado, hígado incluido y suero, respectivamente. Las muestras de suero se aislaron mediante separación en gel y luego se congelaron; las muestras primarias de hígado se congelaron instantáneamente en N2 líquido; una segunda muestra de hígado de cada donante se incrustó en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y se congeló instantáneamente en un molde criogénico. Se obtuvieron dos hígados casi completos y se evaluó la distribución de AV dentro y entre los lóbulos. Las muestras se enviaron en hielo seco a Madison, WI, y se almacenaron en un congelador a -80 °C.

Las muestras de hígado incluidas en OCT se prepararon como secciones congeladas de 5 µm usando un criostato y se tiñeron usando protocolos y reactivos de hematoxilina y eosina de rutina y tricrómico de Masson (Newcomer Supply, Middleton, WI). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de campo claro Nikon E-600 (Melville, NY) y una cámara de microscopía digital Olympus DP-71 (Center Valley, PA). Se pesaron muestras de hígado (1 g) para análisis de VA y carotenoides y luego se molieron con sulfato de sodio (4-5 g) en un mortero usando métodos publicados con modificaciones menores. Se añadió beta-apo-carotenol C-23 purificado para determinar las eficiencias de extracción. Las muestras se extrajeron repetidamente con diclorometano y se filtraron a través de WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) en matraces volumétricos de 50 ml. Se secó una alícuota (5 mL) bajo nitrógeno, se volvió a disolver en 300 µL de metanol:dicloroetano (75:25, volumen:volumen) y se inyectó una alícuota de 1 µL en un cromatógrafo de líquidos de ultrapresión Waters Acquity H-Class ( UPLC®) equipado con un detector de matriz de fotodiodos (Milford, MA). Las alícuotas se saponificaron adicionalmente para la cuantificación del alfa-retinol total como se describe a continuación para los análisis de lóbulo. Para las evaluaciones de las muestras del lóbulo hepático, se extrajeron muestras de 1 g por triplicado de cada lóbulo disponible. Se saponificó una alícuota de 5 mL del extracto con 400 mL de hidróxido de potasio:agua (50:50, peso:volumen) a 45°C durante 1 h. La reacción se inactivó con 0,5 ml de agua y se extrajo tres veces con 0,5 ml de hexanos. Las capas de hexano se juntaron y secaron bajo nitrógeno, se volvieron a disolver en 150 µL de metanol:dicloroetano (75:25, volumen:volumen) y se inyectó una alícuota de 1 µL en el sistema UPLC®.

Las muestras de suero (0,5 ml) se dividieron en alícuotas en tubos de ensayo para la determinación de retinol y RE; Se añadió 1,25 X volumen de etanol para desnaturalizar las proteínas. El estándar interno fue C23-β-apo-carotenol. Las muestras se extrajeron tres veces con 0,75 ml de hexanos; las fracciones sobrenadantes se agruparon y se secaron bajo nitrógeno y se reconstituyeron en 100 µl de metanol:dicloroetano (75:25, volumen:volumen). Se inyectaron dos µl en la UPLC® en las condiciones que se describen a continuación. Se analizaron la proteína C reactiva (PCR) y la glicoproteína ácida alfa1 (AGP) séricas para evaluar la inflamación utilizando kits ELISA (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Las concentraciones de licopeno y alfa- y beta-caroteno se determinaron mediante análisis HPLC de rutina.

Método de cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC) Se utilizó una precolumna Waters Acquity UPLC HSS C18 de 1,8 µm VanGuard junto con una columna Waters Acquity UPLC® HSS C18 (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). El método utilizó dos mezclas de solventes programadas para un gradiente de 29 min. El solvente A era acetonitrilo-agua-isopropanol (70:25:5, volumen:volumen:volumen) con 10 mmol/L de acetato de amonio y el solvente B era metanol-isopropanol (75:25, volumen:volumen). La temperatura de la columna se ajustó a 32 °C y la velocidad de flujo fue de 0,4 ml/min. El gradiente comenzó manteniendo el disolvente A al 100 % durante 7 min, seguido de una transición lineal de 4 min al 5 % de A y otra transición al 1 % de A durante 12 min. El gradiente de solvente luego se invirtió a 100% A en 2 min y se equilibró durante 4 min. Los cromatogramas se generaron a 311 nm para α-retinol y α-RE, 325 nm para retinol y RE y 450 nm para carotenoides. Los alfa-RE, derivados casi exclusivamente del betacaroteno en la dieta, se cuantificaron como un indicador de la exposición a vegetales a largo plazo. Las concentraciones se calcularon usando curvas estándar derivadas de estándares auténticos purificados por HPLC de α-retinol y retinol.