A-vitamiinin maksavarastot ja A-vitamiinin seerumin markkerit yhdysvaltalaisilla aikuisilla kuolemanhetkellä

Ihmisillä on vain vähän tietoa todellisesta maksan A-vitamiinista verrattuna veren biomarkkereihin. Yhden veren biomarkkerin, prosenttiosuuden seerumin kokonaisretinolista (A-vitamiini) retinyyliesterien muodossa, on ehdotettu diagnosoimaan hypervitaminoosi A 5 % ja 10 % raja-arvoilla. Tässä tutkimuksessa tutkijat pyrkivät vertaamaan maksan A-vitamiinin kokonaisvarantoja seerumin retinolin kokonaismäärään retinyyliestereinä hypervitaminoosi A:n arvioimiseksi käyttämällä yhdysvaltalaisilta aikuisilta otettuja ruumiinavausnäytteitä. Tutkijat arvioivat myös seerumin retinolin herkkyyttä (biomarkkerin kyky tunnistaa puutospotilaat oikein) ja spesifisyyttä (biomarkkerin kyky tunnistaa ne, joilla ei ole puutetta) määrittääkseen A-vitamiinin puutteen, maksan A-vitamiinipitoisuuden vaihtelun lohkoissa. ja maksan alfa-retinyyliesteripitoisuudet, alfa-karoteenin, A-vitamiinin esiasteen, pilkkoutumistuote.

Tutkimuksen suorittamista varten hankittiin yhteensopivia seerumi- ja maksanäytteitä 27 aikuiselta yhdysvaltalaiselta ruumiilta (luovuttajilta iältään 49-101 vuotta) ja heidän A-vitamiinibiomarkkerinsa analysoitiin. Täsmälliset ihmisen maksa- ja seeruminäytteet kerättiin 27 ruumiista, 13 miehestä ja 14 naisesta, ja hankittiin peräkkäisenä näytteenä National Disease Research Interchange -palveluun tehdyllä pyynnöllä. Myös tunnistamattomat kliinisen historian yhteenvedot saatiin. Luovuttajien kriteerit olivat seuraavat: ei rotuun tai sukupuoleen liittyviä rajoituksia, ei aiemmin ollut kemoterapiaa ja/tai säteilyä, ei historiaa pitkittynyttä endotrakeaalista intubaatiota tai ventilaatiota, ei todisteita sepsisestä tai infektiotaudista (negatiivinen serologiapaneeli) ja ikähaarukka 21 -54 v, 55-74 v ja >75 v (kohdekokoelma oli 5 mies- ja 5 naisluovuttajaa ikäryhmää kohden epähomogeenisen näytteen saamiseksi). Kun kustakin ikäryhmästä (eli 55-74-vuotiaat ja >75-vuotiaat) oli hankittu 10 yksilöä, näytteitä ei enää pyydetty. Kaikki kudokset ja seerumit hankittiin 16 tunnin kuluessa post mortem syyskuusta 2013 elokuuhun 2016. Hankintaprotokollan numerot olivat DWEN1 002 022, 002 023 ja 002 024 jäädytetylle maksalle, upotetulle maksalle ja seerumille. Seeruminäytteet eristettiin geelierotuksella ja jäädytettiin sitten; primaariset maksanäytteet pikapakastettiin nestemäiseen N2:een; toinen maksanäyte jokaiselta luovuttajalta upotettiin optimaalisen leikkauslämpötilan yhdisteeseen (OCT) ja pikapakastettiin kryomuottiin. Kaksi maksaa hankittiin lähes kokonaisina ja arvioitiin VA:n jakautumisen suhteen lohkoissa ja niiden välillä. Näytteet lähetettiin kuivajäällä Madisoniin, WI, ja niitä säilytettiin -80 °C:n pakastimessa.

OCT-upotetut maksanäytteet valmistettiin 5 um:n jäädytetyiksi leikkeiksi kryostaattia käyttäen ja värjättiin käyttämällä rutiinia hematoksyliinia ja eosiinia sekä Massonin trikromiprotokollia ja -reagensseja (Newcomer Supply, Middleton, WI). Kuvat otettiin käyttämällä Nikon E-600 -kirkaskenttämikroskooppia (Melville, NY) ja Olympus DP-71 -digitaalimikroskooppikameraa (Center Valley, PA). Maksanäytteet (1 g) VA- ja karotenoidianalyysejä varten punnittiin ja jauhettiin sitten natriumsulfaatilla (4-5 g) huhmaressa ja survimessa käyttäen julkaistuja menetelmiä pienin muutoksin. Puhdistettua C-23-beeta-apo-karotenolia lisättiin uuttotehokkuuksien määrittämiseksi. Näytteet uutettiin toistuvasti dikloorimetaanilla ja suodatettiin WhatmanTM #1:n (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) läpi 50 ml:n mittapulloihin. Erä (5 ml) kuivattiin typen alla, liuotettiin uudelleen 300 µl:aan metanoli:dikloorietaania (75:25, tilavuus:tilavuus) ja 1 µl:n alikvootti injektoitiin Waters Acquity H-luokan ultrapainenestekromatografiin ( UPLC®) järjestelmä, joka on varustettu valodiodirividetektorilla (Milford, MA). Alikvootteja saippuoitettiin edelleen kokonaisalfa-retinolin kvantifiointia varten, kuten alla on kuvattu lohkoanalyyseille. Maksalohkonäytteiden arvioimiseksi 1 g:n näytteitä uutettiin kolmena kappaleena kustakin käytettävissä olevasta lohkosta. Uutteen 5 ml:n alikvootti saippuoitiin 400 ml:lla kaliumhydroksidi:vettä (50:50, paino:tilavuus) 45 °C:ssa 1 tunnin ajan. Reaktio sammutettiin 0,5 ml:lla vettä ja uutettiin kolme kertaa 0,5 ml:lla heksaaneja. Heksaanikerrokset yhdistettiin ja kuivattiin typen alla, liuotettiin uudelleen 150 ul:aan metanoli:dikloorietaania (75:25, tilavuus:tilavuus), ja 1 ui:n alikvootti injektoitiin UPLC®-järjestelmään.

Seeruminäytteet (0,5 ml) jaettiin koeputkiin retinolin ja RE:n määritystä varten; 1,25 X tilavuus etanolia lisättiin denaturoimaan proteiineja. Sisäinen standardi oli C23-β-apo-karotenoli. Näytteet uutettiin kolme kertaa 0,75 ml:lla heksaaneja; supernatanttifraktiot yhdistettiin ja kuivattiin typen alla ja liuotettiin 100 ui:aan metanoli:dikloorietaania (75:25, tilavuus:tilavuus). Kaksi ui injektoitiin UPLC®:iin alla kuvatuissa olosuhteissa. Seerumin C-reaktiivinen proteiini (CRP) ja alfa1-happoglykoproteiini (AGP) analysoitiin tulehduksen arvioimiseksi käyttämällä ELISA-pakkauksia (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Lykopeeni- ja alfa- ja beetakaroteenipitoisuudet määritettiin rutiininomaisella HPLC-analyysillä.

Ultra-high Performance Liquid Kromatograph (UPLC) -menetelmä Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard-esikolonnia käytettiin yhdessä Waters Acquity UPLC® HSS C18 -kolonnin (1,8 µm, 2,1 x 150 mm) kanssa. Menetelmässä käytettiin kahta liuotinseosta, jotka oli ohjelmoitu 29 minuutin gradientille. Liuotin A oli asetonitriili-vesi-isopropanoli (70:25:5, tilavuus:tilavuus:tilavuus) ja 10 mmol/l ammoniumasetaattia ja liuotin B oli metanoli-isopropanoli (75:25, tilavuus:tilavuus). Kolonnin lämpötila asetettiin 32 °C:seen ja virtausnopeus oli 0,4 ml/min. Gradientti alkoi pitämällä 100 % liuotinta A 7 minuutin ajan, mitä seurasi 4 minuutin lineaarinen siirtyminen 5 % A:iin ja toinen siirtyminen 1 % A:iin 12 minuutin aikana. Liuotingradientti käännettiin sitten 100 % A:ksi 2 minuutissa ja tasapainotettiin 4 minuutin ajan. Kromatogrammit luotiin aallonpituudella 311 nm a-retinolille ja a-RE:lle, 325 nm retinolille ja RE:lle ja 450 nm karotenoideille. Alfa-RE:t, jotka on johdettu lähes yksinomaan ruokavalion beetakaroteenista, määritettiin pitkäkestoisen kasvisten altistumisen proksiksi. Konsentraatiot laskettiin käyttämällä standardikäyriä, jotka oli johdettu autenttisista HPLC-puhdistetuista a-retinolin ja retinolin standardeista.