Az A-vitamin májtartalékai és az A-vitamin szérum markerei amerikai felnőtteknél a halál idején

Minimális emberi adatok állnak rendelkezésre a tényleges máj-A-vitaminról a vér biomarkereivel összehasonlítva. Egy vér biomarker, a teljes szérum retinol (A-vitamin) százalékos aránya retinil-észterek formájában, az A hipervitaminózis diagnosztizálására javasolt 5%-os és 10%-os határértékkel. Ebben a tanulmányban a kutatók a máj teljes A-vitamin-tartalékát a retinil-észterek formájában lévő teljes szérum retinol százalékos arányával kívánják összehasonlítani, hogy kiértékeljék az A-hipervitaminózist amerikai felnőttek boncolási mintái segítségével. A kutatók értékelik a szérum retinol érzékenységét (a biomarker azon képességét is, hogy helyesen azonosítja a hiányos betegeket) és specificitását (a biomarker azon képességét, hogy helyesen azonosítja azokat, akiknek nincs hiánya), hogy meghatározzák az A-vitamin-hiányt, valamint a máj A-vitamin-koncentrációjának változását a lebenyek között. , és a máj alfa-retinil-észter-koncentrációja, az alfa-karotin, az A-vitamin prekurzora hasadási terméke.

A vizsgálat lefolytatásához 27 amerikai felnőtt holttesttől (49-101 éves donoroktól) megfelelő szérum- és májmintákat szereztek be, és elemezték az A-vitamin biomarkereiket. A megfelelő humán máj- és szérummintákat 27 holttestből, 13 férfiból és 14 nőstényből gyűjtöttük, és a National Disease Research Interchange szolgálathoz intézett kéréssel egymást követő mintaként szereztük be. Az azonosítás nélküli klinikai anamnézis összefoglalókat is megkaptuk. A donor kritériumai a következők voltak: nincs rasszra vagy nemre vonatkozó korlátozás, nem szerepelt kemoterápia és/vagy sugárkezelés anamnézisében, nem szerepelt hosszan tartó endotracheális intubáció vagy lélegeztetés, nincs szepszisre vagy fertőző betegségre utaló jel (negatív szerológiai panel), és 21 éves korhatár -54 év, 55-74 év és 75 év feletti (a célcsoport 5 férfi és 5 női donor volt életkoronként, hogy nem homogén mintát kapjunk). Miután minden korcsoportban (azaz 55-74 évesek és >75 évesek) 10 egyént szereztek be, többé nem kértek mintát. Minden szövetet és szérumot a levágást követő 16 órán belül szereztek be 2013 szeptemberétől 2016 augusztusáig. A beszerzési protokoll száma a DWEN1 002 022, 002 023 és 002 024 volt a fagyasztott máj, a beágyazott máj és a szérum esetében. A szérummintákat gélszétválasztással izoláltuk, majd lefagyasztottuk; az elsődleges májmintákat folyékony N2-ben pillanatok alatt lefagyasztottuk; minden donortól egy második májmintát ágyaztunk be optimális vágási hőmérsékletű keverékbe (OCT), és egy kriomoldában gyorsan lefagyasztottuk. Két májat csaknem egészben szereztünk be, és megvizsgáltuk a VA eloszlását a lebenyeken belül és azok között. A mintákat szárazjégen szállítottuk Madisonba, WI, és -80 °C-os fagyasztóban tároltuk.

Az OCT-beágyazott májmintákat 5 µm-es fagyasztott metszetként készítettük el kriosztát segítségével, és rutin hematoxilin és eozin, valamint Masson-féle trikróm protokollok és reagensek (Newcomer Supply, Middleton, WI) alkalmazásával festették meg. A képek Nikon E-600 fényerejű mikroszkóppal (Melville, NY) és Olympus DP-71 digitális mikroszkópos kamerával (Center Valley, PA) készültek. A VA és karotinoid analízishez szükséges májmintákat (1 g) lemértük, majd nátrium-szulfáttal (4-5 g) mozsárban és mozsártörőben őröltük a publikált módszerekkel, kisebb módosításokkal. Tisztított C-23 béta-apo-karotinolt adtunk hozzá az extrakciós hatékonyság meghatározásához. A mintákat többször extraháltuk diklór-metánnal, és WhatmanTM #1-en (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) 50 ml-es mérőlombikokba szűrtük. Egy alikvot részt (5 ml) nitrogén alatt szárítottunk, újra feloldottunk 300 µl metanol:diklór-etán (75:25, térfogat:térfogat) elegyben, és egy 1 µl-es alikvot részt Waters Acquity H-osztályú ultranyomásos folyadékkromatográfba injektáltunk. UPLC®) fotodiódasoros detektorral felszerelt rendszer (Milford, MA). Az alikvot részeket tovább szappanosítottuk a teljes alfa-retinol mennyiségi meghatározásához, a lebenyelemzéseknél leírtak szerint. A májlebeny-minta értékeléséhez 1 g-os mintát vettünk három párhuzamosban minden rendelkezésre álló lebenyből. Az extraktum 5 ml-es aliquot részét 400 ml kálium-hidroxid:víz (50:50, tömeg:térfogat) eleggyel elszappanosítjuk 45 °C-on 1 órán át. A reakciót 0,5 ml vízzel leállítjuk, és háromszor 0,5 ml hexánnal extraháljuk. A hexános rétegeket egyesítettük és nitrogén alatt szárítottuk, 150 µl metanol:diklór-etán (75:25, térfogat:térfogat) elegyben újra feloldottuk, és 1 µl-es alikvot részt injektáltunk az UPLC® rendszerbe.

A szérummintákat (0,5 ml) kémcsövekbe osztottuk a retinol és a RE meghatározásához; 1,25-szeres térfogatú etanolt adtunk a denaturált fehérjékhez. A belső standard C23-β-apo-karotinol volt. A mintákat háromszor extraháltuk 0,75 ml hexánnal; a felülúszó frakciókat összeöntöttük, nitrogén alatt szárítottuk, majd 100 µl metanol/diklór-etán (75:25, térfogat:térfogat) elegyében rekonstituáltuk. Két µl-t injektáltunk az UPLC®-be az alábbiakban leírt körülmények között. A szérum C-reaktív fehérjét (CRP) és az alfa1-savas glikoproteint (AGP) elemeztük a gyulladás értékelésére ELISA kitekkel (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). A likopin, valamint az alfa- és béta-karotin koncentrációját rutin HPLC analízissel határoztuk meg.

Ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográf (UPLC) módszer Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard előoszlopot használtunk Waters Acquity UPLC® HSS C18 oszloppal (1,8 µm, 2,1 x 150 mm) együtt. A módszer két, 29 perces gradiensre programozott oldószerkeveréket használt. Az A oldószer acetonitril-víz-izopropanol (70:25:5, térfogat:térfogat:térfogat) 10 mmol/l ammónium-acetáttal, a B oldószer pedig metanol-izopropanol (75:25, térfogat:térfogat). Az oszlop hőmérsékletét 32 °C-ra állítottuk be, és az áramlási sebesség 0,4 ml/perc volt. A gradiens azzal kezdődött, hogy 100%-os A oldószert tartottak 7 percig, majd 4 perces lineáris átmenetet 5% A-ra, majd egy újabb átmenetet 1% A-ra 12 percen keresztül. Az oldószer gradienst ezután 2 perc alatt 100% A-ra fordítottuk, és 4 percig kiegyensúlyoztuk. A kromatogramokat 311 nm-en α-retinolhoz és α-RE-hez, 325 nm-en retinolhoz és RE-hez, valamint 450 nm-en karotinoidokhoz készítettük. Az alfa-RE-ket, amelyek szinte kizárólag az étrendben lévő béta-karotinból származnak, számszerűsítették a hosszú távú növényi expozíció helyettesítőjeként. A koncentrációkat hiteles, HPLC-vel tisztított α-retinol és retinol standard görbéivel számítottuk ki.