Vitamin A-leverreserver och serummarkörer för vitamin A hos vuxna i USA vid tidpunkten för döden

Minimala mänskliga data finns om faktiska levervitamin A jämfört med blodbiomarkörer. En blodbiomarkör, procentandelen av totalt serumretinol (vitamin A) i form av retinylestrar, har föreslagits för att diagnostisera hypervitaminos A med cutoffs på 5 % och 10 %. I denna studie syftar utredarna till att jämföra totala vitamin A-reserver i levern med procentandelen total serumretinol som retinylestrar för att utvärdera hypervitaminos A med hjälp av obduktionsprover från amerikanska vuxna. Utredarna utvärderar också känsligheten (förmågan hos biomarkören att korrekt identifiera de med brist) och specificiteten (förmågan hos biomarkören att korrekt identifiera de utan brist) hos serumretinol för att bestämma A-vitaminbrist, variation i leverns A-vitaminkoncentration bland lober. , och lever alfa retinyl ester koncentrationer, en klyvningsprodukt av alfa-karoten, en vitamin A-prekursor.

För att genomföra studien togs matchade serum- och leverprover från 27 amerikanska vuxna kadaver (från donatorer i åldern 49-101 år) och deras vitamin A-biomarkörer analyserades. Matchade humana lever- och serumprover samlades in från 27 kadaver, 13 män och 14 kvinnor, och förvärvades som ett på varandra följande prov genom en begäran till National Disease Research Interchange-tjänsten. Avidentifierade sammanfattningar av klinisk historia erhölls också. Givarkriterierna var följande: inga restriktioner för ras eller kön, ingen historia av kemoterapi och/eller strålning, ingen historia av förlängd endotrakeal intubation eller ventilation, inga tecken på sepsis eller infektionssjukdom (negativ serologipanel) och åldersintervall på 21 -54 år, 55-74 år och >75 år (målinsamlingen var 5 manliga och 5 kvinnliga donatorer per åldersintervall för att ge ett icke-homogent prov). Efter att 10 individer förvärvats i varje åldersintervall (dvs 55-74 år och >75 år), begärdes inte längre prover. Alla vävnader och sera tillvaratogs inom 16 timmar post mortem från september 2013 till augusti 2016. Upphandlingsprotokollsnumren var DWEN1 002 022, 002 023 och 002 024 för fryst lever, inbäddad lever respektive serum. Serumprover isolerades via gelseparation och frystes sedan; primära leverprover snabbfrystes i flytande N2; ett andra leverprov från varje donator bäddades in i optimal skärtemperaturförening (OCT) och snabbfrystes i en kryomull. Två levrar anskaffades nästan hela och utvärderades för VA-fördelning inom och mellan lober. Prover skickades på torris till Madison, WI, och lagrades i en -80°C frys.

OCT-inbäddade leverprover preparerades som 5 µm frysta sektioner med användning av en kryostat och färgades med rutinmässiga hematoxylin och eosin och Massons trikromprotokoll och reagens (Newcomer Supply, Middleton, WI). Bilderna togs med ett Nikon E-600 ljusfältsmikroskop (Melville, NY) och Olympus DP-71 digital mikroskopikamera (Center Valley, PA). Leverprover (1 g) för VA- och karotenoidanalyser vägdes och maldes sedan med natriumsulfat (4-5 g) i en mortel och mortelstöt med användning av publicerade metoder med mindre modifieringar. Renad C-23 beta-apo-karotenol tillsattes för att bestämma extraktionseffektivitet. Prover extraherades upprepade gånger med diklormetan och filtrerades genom WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) i 50 ml mätkolvar. En alikvot (5 mL) torkades under kväve, återupplöstes i 300 µL metanol:dikloretan (75:25, volym:volym) och en alikvot på 1 µL injicerades i en Waters Acquity H-Class ultratrycksvätskekromatograf ( UPLC®)-system utrustat med en fotodiodmatrisdetektor (Milford, MA). Alikvoter förtvålades ytterligare för kvantifiering av total alfa-retinol såsom beskrivs nedan för lobanalyserna. För utvärderingar av leverlobsprovet extraherades 1 g prover i tre exemplar från varje tillgänglig lob. En 5 ml alikvot av extraktet förtvålades med 400 ml kaliumhydroxid:vatten (50:50, vikt:volym) vid 45°C under 1 timme. Reaktionen släcktes med 0,5 ml vatten och extraherades tre gånger med 0,5 ml hexaner. Hexanskikten slogs samman och torkades under kväve, återupplöstes i 150 µL metanol:dikloretan (75:25, volym:volym), och en alikvot på 1 µL injicerades i UPLC®-systemet.

Serumprover (0,5 ml) alikvoterades i provrör för retinol- och RE-bestämning; 1,25 X volym etanol tillsattes för att denaturera proteiner. Den interna standarden var C23-p-apo-karotenol. Prover extraherades tre gånger med 0,75 ml hexaner; supernatantfraktionerna slogs samman och torkades under kväve och rekonstituerades i 100 µL metanol:dikloretan (75:25, volym:volym). Två µL injicerades i UPLC® under de betingelser som beskrivs nedan. Serum C-reaktivt protein (CRP) och alfa1-syraglykoprotein (AGP) analyserades för att utvärdera inflammation med användning av ELISA-kit (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Lykopen- och alfa- och betakarotenkoncentrationer bestämdes genom rutin-HPLC-analys.

Ultrahögpresterande vätskekromatografmetod (UPLC) En Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard-prekolonn användes tillsammans med en Waters Acquity UPLC® HSS C18-kolonn (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). Metoden använde två lösningsmedelsblandningar programmerade för en 29-minuters gradient. Lösningsmedel A var acetonitril-vatten-isopropanol (70:25:5, volym:volym:volym) med 10 mmol/L ammoniumacetat och lösningsmedel B var metanol-isopropanol (75:25, volym:volym). Kolonntemperaturen sattes till 32°C och flödeshastigheten var 0,4 ml/min. Gradienten började med att hålla 100 % lösningsmedel A i 7 minuter, följt av en 4-minuters linjär övergång till 5 % A och ytterligare en övergång till 1 % A under 12 minuter. Lösningsmedelsgradienten vändes sedan till 100 % A på 2 minuter och jämviktades under 4 minuter. Kromatogram genererades vid 311 nm för α-retinol och α-REs, 325 nm för retinol och REs, och 450 nm för karotenoider. alfa-RE, som nästan uteslutande härrör från betakaroten i kosten, kvantifierades som en proxy för långvarig exponering för grönsaker. Koncentrationerna beräknades med användning av standardkurvor härledda från autentiska HPLC-renade standarder av a-retinol och retinol.