미국 성인의 사망 시 비타민 A 간 보유량과 비타민 A의 혈청 표지자

혈액 바이오마커와 비교하여 실제 간 비타민 A에 대한 최소한의 인간 데이터가 존재합니다. 레티닐 에스테르 형태의 총 혈청 레티놀(비타민 A)의 백분율인 하나의 혈액 바이오마커는 5%와 10%의 컷오프로 비타민 A 과다증을 진단하는 데 제안되었습니다. 이 연구에서 조사관은 미국 성인의 부검 샘플을 사용하여 비타민 A 과다증을 평가하기 위해 총 간 비타민 A 보유량과 레티닐 에스테르로서의 총 혈청 레티놀 백분율을 비교하는 것을 목표로 합니다. 조사관은 또한 혈청 레티놀의 민감도(결핍이 있는 사람을 정확하게 식별하는 바이오마커의 능력) 및 특이성(결핍이 없는 사람을 정확하게 식별하는 바이오마커의 능력)을 평가하여 비타민 A 결핍, 간엽 간 비타민 A 농도의 변화를 결정합니다. , 간 알파 레티닐 에스테르 농도, 비타민 A 전구체인 알파-카로틴의 분해 생성물.

연구를 수행하기 위해 일치하는 혈청 및 간 샘플을 27명의 미국 성인 사체(49-101세 기증자)에서 조달하고 이들의 비타민 A 바이오마커를 분석했습니다. 남성 13명, 여성 14명 사체 27구에서 일치하는 인간 간 및 혈청 샘플을 채취하여 National Disease Research Interchange 서비스에 요청하여 연속 샘플로 획득하였다. 식별되지 않은 임상 병력 요약도 입수했습니다. 기증자 기준은 다음과 같습니다: 인종이나 성별에 대한 제한 없음, 화학 요법 및/또는 방사선 병력 없음, 장기 기관내 삽관 또는 인공호흡의 병력 없음, 패혈증 또는 전염병의 증거 없음(음성 혈청 검사 패널), 연령 범위 21세 -54세, 55-74세 및 >75세(목표 수집은 비균질 샘플을 제공하기 위해 연령 범위당 남성 기증자 5명과 여성 기증자 5명이었습니다). 각 연령 범위(즉, 55-74세 및 >75세)에서 10명의 개인이 획득된 후 샘플이 더 이상 요청되지 않았습니다. 모든 조직과 혈청은 2013년 9월부터 2016년 8월까지 사후 16시간 이내에 조달되었습니다. 조달 프로토콜 번호는 각각 냉동 간, 포매된 간 및 혈청에 대해 DWEN1 002 022, 002 023 및 002 024였습니다. 혈청 샘플을 겔 분리를 통해 분리한 다음 동결했습니다. 1차 간 샘플은 액체 N2에서 급속 냉동되었습니다. 각 공여자의 두 번째 간 샘플을 최적의 절단 온도 화합물(OCT)에 삽입하고 극저온 몰드에서 급속 냉동했습니다. 2개의 간을 거의 전체로 조달하여 엽 내부 및 엽 사이의 VA 분포를 평가했습니다. 샘플은 드라이아이스에 담겨 위스콘신 주 매디슨으로 배송되었으며 -80°C 냉동고에 보관되었습니다.

OCT 내장 간 샘플은 저온 유지 장치를 사용하여 5μm 동결 절편으로 준비하고 일상적인 헤마톡실린 및 에오신과 Masson의 트리크롬 프로토콜 및 시약(Newcomer Supply, Middleton, WI)을 사용하여 염색했습니다. Nikon E-600 명시야 현미경(Melville, NY) 및 Olympus DP-71 디지털 현미경 카메라(Center Valley, PA)를 사용하여 이미지를 캡처했습니다. VA 및 카로티노이드 분석을 위한 간 샘플(1g)의 무게를 잰 다음 약간 수정한 공개된 방법을 사용하여 막자 사발과 막자에서 황산나트륨(4-5g)으로 분쇄했습니다. 정제된 C-23 베타-아포-카로테놀을 첨가하여 추출 효율을 측정했습니다. 샘플을 디클로로메탄으로 반복 추출하고 WhatmanTM #1(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)을 통해 50mL 부피 플라스크로 여과했습니다. 분취량(5mL)을 질소 하에서 건조하고 300µL 메탄올:디클로로에탄(75:25, 부피:부피)에 재용해하고 1µL의 분취량을 Waters Acquity H-Class 초압 액체 크로마토그래프에 주입했습니다( UPLC®) 포토다이오드 어레이 검출기가 장착된 시스템(Milford, MA). 엽 분석을 위해 하기 기재된 바와 같이 총 알파-레티놀의 정량화를 위해 분취량을 추가로 비누화하였다. 간엽 샘플 평가를 위해, 1g 샘플을 각각의 가용한 엽으로부터 삼중으로 추출하였다. 추출물 5mL 분취량을 400mL 수산화칼륨:물(50:50, 중량:부피)로 45°C에서 1시간 동안 비누화했습니다. 반응물을 0.5mL 물로 켄칭하고 0.5mL 헥산으로 3회 추출하였다. 헥산 층을 모으고 질소 하에서 건조하고 150µL 메탄올:디클로로에탄(75:25, 부피:부피)에 재용해하고 1µL의 분취량을 UPLC® 시스템에 주입했습니다.

레티놀 및 RE 결정을 위해 혈청 샘플(0.5mL)을 시험관에 분취하였다. 1.25 X 부피의 에탄올을 첨가하여 단백질을 변성시켰다. 내부 표준은 C23-β-apo-carotenol이었습니다. 샘플을 0.75mL 헥산으로 3회 추출했습니다. 상청액 분획을 모으고 질소 하에서 건조하고 100 μL 메탄올:디클로로에탄(75:25, 부피:부피)에서 재구성했습니다. 아래 설명된 조건에서 2μL를 UPLC®에 주입했습니다. ELISA 키트(CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam)를 사용하여 염증을 평가하기 위해 혈청 C-반응성 단백질(CRP) 및 알파1-산 당단백질(AGP)을 분석했습니다. 리코펜 및 알파- 및 베타-카로틴 농도는 일상적인 HPLC 분석에 의해 결정되었습니다.

초고성능 액체 크로마토그래프(UPLC) 방법 A Waters Acquity UPLC HSS C18 1.8µm VanGuard 예비 컬럼을 Waters Acquity UPLC® HSS C18 컬럼(1.8µm, 2.1 x 150mm)과 함께 사용했습니다. 이 방법은 29분 구배로 프로그래밍된 두 가지 용매 혼합물을 사용했습니다. 용매 A는 10mmol/L 암모늄 아세테이트를 포함하는 아세토니트릴-물-이소프로판올(70:25:5, 부피:부피:부피)이었고 용매 B는 메탄올-이소프로판올(75:25, 부피:부피)이었다. 컬럼 온도는 32°C로 설정되었고 유속은 0.4mL/분이었습니다. 구배는 7분 동안 100% 용매 A를 유지하여 시작한 다음 4분 동안 5% A로 선형 전이하고 12분에 걸쳐 1% A로 다시 전이합니다. 이어서 용매 구배를 2분 내에 100% A로 역전시키고 4분 동안 평형화시켰다. 크로마토그램은 α-레티놀 및 α-RE의 경우 311nm, 레티놀 및 RE의 경우 325nm, 카로티노이드의 경우 450nm에서 생성되었습니다. 식단의 베타카로틴에서 거의 독점적으로 파생된 알파-RE는 장기간 야채 노출에 대한 프록시로 정량화되었습니다. 농도는 α-레티놀 및 레티놀의 정품 HPLC 정제 표준에서 파생된 표준 곡선을 사용하여 계산되었습니다.