Vitamine A-leverreserves en serummarkers van vitamine A bij Amerikaanse volwassenen op het moment van overlijden

Er zijn minimale menselijke gegevens over werkelijke levervitamine A in vergelijking met bloedbiomarkers. Eén bloedbiomarker, het percentage van totaal serumretinol (vitamine A) in de vorm van retinylesters, is voorgesteld om hypervitaminose A te diagnosticeren met afkapwaarden van 5% en 10%. In deze studie proberen onderzoekers de totale vitamine A-reserves in de lever te vergelijken met het percentage totale serumretinol als retinylesters om hypervitaminose A te evalueren met behulp van autopsiemonsters van Amerikaanse volwassenen. Onderzoekers evalueren ook de gevoeligheid (het vermogen van de biomarker om mensen met een tekort correct te identificeren) en specificiteit (het vermogen van de biomarker om mensen zonder tekort correct te identificeren) van serumretinol om vitamine A-tekort, variatie van vitamine A-concentratie in de lever tussen lobben te bepalen en alfa-retinylesterconcentraties in de lever, een splitsingsproduct van alfa-caroteen, een vitamine A-precursor.

Om het onderzoek uit te voeren, werden gematchte serum- en levermonsters verkregen van 27 volwassen kadavers in de VS (van donoren van 49-101 jaar oud) en hun vitamine A-biomarkers werden geanalyseerd. Gematchte menselijke lever- en serummonsters werden verzameld van 27 kadavers, 13 mannen en 14 vrouwen, en verkregen als een opeenvolgend monster via een verzoek aan de National Disease Research Interchange-service. Er werden ook geanonimiseerde samenvattingen van de klinische geschiedenis verkregen. De donorcriteria waren als volgt: geen beperkingen op ras of geslacht, geen voorgeschiedenis van chemotherapie en/of bestraling, geen voorgeschiedenis van langdurige endotracheale intubatie of beademing, geen bewijs van sepsis of infectieziekte (negatief serologisch panel) en leeftijdscategorieën van 21 jaar. -54 jaar, 55-74 jaar en >75 jaar (doelverzameling was 5 mannelijke en 5 vrouwelijke donoren per leeftijdscategorie om een ​​niet-homogeen monster te verkrijgen). Nadat 10 personen waren verkregen in elke leeftijdscategorie (d.w.z. 55-74 jaar en> 75 jaar), werden er geen monsters meer gevraagd. Alle weefsels en sera werden verkregen binnen 16 uur post-mortem van september 2013 tot augustus 2016. De nummers van het inkoopprotocol waren DWEN1 002 022, 002 023 en 002 024 voor respectievelijk bevroren lever, ingebedde lever en serum. Serummonsters werden geïsoleerd via gelscheiding en vervolgens ingevroren; primaire levermonsters werden snel ingevroren in vloeibare N2; een tweede levermonster van elke donor werd ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en snel ingevroren in een cryomold. Twee levers werden bijna geheel verkregen en beoordeeld op VA-distributie binnen en tussen lobben. Monsters werden op droogijs verzonden naar Madison, WI, en opgeslagen in een vriezer van -80°C.

In OCT ingebedde levermonsters werden bereid als bevroren coupes van 5 µm met behulp van een cryostaat en gekleurd met routinematige hematoxyline en eosine en Masson's trichroomprotocollen en reagentia (Newcomer Supply, Middleton, WI). Beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon E-600 helderveldmicroscoop (Melville, NY) en Olympus DP-71 digitale microscopiecamera (Center Valley, PA). Levermonsters (1 g) voor VA- en carotenoïde-analyses werden gewogen en vervolgens gemalen met natriumsulfaat (4-5 g) in een vijzel met behulp van gepubliceerde methoden met kleine aanpassingen. Gezuiverd C-23 beta-apo-carotenol werd toegevoegd om de extractie-efficiëntie te bepalen. Monsters werden herhaaldelijk geëxtraheerd met dichloormethaan en gefiltreerd door WhatmanTM #1 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) in maatkolven van 50 ml. Een aliquot (5 ml) werd gedroogd onder stikstof, opnieuw opgelost in 300 µl methanol:dichloorethaan (75:25, volume:volume) en een aliquot van 1 µl werd geïnjecteerd in een Waters Acquity H-Class ultradruk vloeistofchromatograaf ( UPLC®) systeem uitgerust met een fotodiode-arraydetector (Milford, MA). Aliquots werden verder verzeept voor kwantificering van totaal alfa-retinol zoals hieronder beschreven voor de lobanalyses. Voor de evaluaties van de leverkwabmonsters werden monsters van 1 g in drievoud geëxtraheerd uit elke beschikbare lob. Een portie van 5 ml van het extract werd verzeept met 400 ml kaliumhydroxide:water (50:50, gewicht:volume) bij 45°C gedurende 1 uur. De reactie werd geblust met 0,5 ml water en driemaal geëxtraheerd met 0,5 ml hexanen. De hexaanlagen werden samengevoegd en onder stikstof gedroogd, opnieuw opgelost in 150 µl methanol:dichloorethaan (75:25, volume:volume) en een aliquot van 1 µl werd in het UPLC®-systeem geïnjecteerd.

Serummonsters (0,5 ml) werden in reageerbuizen verdeeld voor bepaling van retinol en RE; 1,25 x volume ethanol werd toegevoegd om eiwitten te denatureren. De interne standaard was C23-β-apo-carotenol. Monsters werden driemaal geëxtraheerd met 0,75 ml hexanen; de bovendrijvende fracties werden samengevoegd en gedroogd onder stikstof en gereconstitueerd in 100 µl methanol:dichloorethaan (75:25, volume:volume). Twee µL werd in de UPLC® geïnjecteerd onder de hieronder beschreven omstandigheden. Serum C-reactief proteïne (CRP) en alfa1-zuur glycoproteïne (AGP) werden geanalyseerd om ontsteking te evalueren met behulp van ELISA-kits (CRP: Cayman Chemical Company; AGP: Abcam). Lycopeen- en alfa- en bèta-caroteenconcentraties werden bepaald door middel van routinematige HPLC-analyse.

UPLC-methode (Ultra High Performance Liquid Chromatograph) Een Waters Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm VanGuard-voorkolom werd gebruikt in combinatie met een Waters Acquity UPLC® HSS C18-kolom (1,8 µm, 2,1 x 150 mm). De methode maakte gebruik van twee oplosmiddelmengsels die waren geprogrammeerd voor een gradiënt van 29 minuten. Oplosmiddel A was acetonitril-water-isopropanol (70:25:5, volume:volume:volume) met 10 mmol/L ammoniumacetaat en oplosmiddel B was methanol-isopropanol (75:25, volume:volume). De kolomtemperatuur werd ingesteld op 32°C en de stroomsnelheid was 0,4 ml/min. De gradiënt begon door gedurende 7 minuten 100% oplosmiddel A vast te houden, gevolgd door een lineaire overgang van 4 minuten naar 5% A en nog een overgang naar 1% A gedurende 12 minuten. De oplosmiddelgradiënt werd vervolgens in 2 minuten omgekeerd naar 100% A en gedurende 4 minuten geëquilibreerd. Chromatogrammen werden gegenereerd bij 311 nm voor α-retinol en α-RE's, 325 nm voor retinol en RE's en 450 nm voor carotenoïden. alfa-RE's, bijna uitsluitend afgeleid van bèta-caroteen in de voeding, werden gekwantificeerd als een proxy voor langdurige blootstelling aan groenten. De concentraties werden berekend met behulp van standaardkrommen afgeleid van authentieke HPLC-gezuiverde standaarden van a-retinol en retinol.