Kvantifikace bakteriální DNA při sepsi

Septický syndrom způsobený infekcemi krevního řečiště představuje celosvětově velký problém zdravotní péče a je hlavní příčinou úmrtnosti na nekardiální jednotce intenzivní péče (JIP). Přes pokračující výzkumné úsilí v sepsi zůstává úmrtnost až 12-30%.

U těžké sepse byla doba do adekvátní antibiotické terapie jasně spojena s přežitím. Na pohotovosti je však náročné identifikovat příčinu klinického obrazu a identifikovat pacienty, pro které by antibiotická léčba měla největší prospěch. Nerozlišující používání antibiotik nevyhnutelně vede k bakteriální rezistenci a nepřijatelným nežádoucím účinkům. Existuje tedy velká a nenaplněná lékařská potřeba vyvinout nové diagnostické nástroje, které by mohly informovat lékaře o tom, kdo by antibiotika potřeboval a kdo by z nich neměl prospěch. Kromě toho by včasná identifikace kauzálního mikroorganismu a zánětlivého stavu pacientů zlepšila rozhodování o léčbě a snížila by podávání antibiotik.

Dnes je zlatým standardem pro diagnostiku infekcí krevního řečiště (BSI) hemokultura následovaná identifikací druhů a vzorců rezistence standardními laboratorními postupy. Tento postup je spojen s vysokou specificitou, ale také s nízkou senzitivitou. Pravděpodobnou příčinou negativní hemokultury i přes silné klinické podezření může být nedostatečný objem krve v kultivačních lahvičkách nebo antibiotická léčba před odběrem krve s následným selháním růstu bakterií v lahvičkách.

V posledních letech byla navržena polymerázová řetězová reakce (PCR) jako metoda stanovení bakteriální DNA na základě amplifikace specifických podjednotek (16S a 18S) bakteriální ribozomální RNA. PCR vyžaduje velmi malé množství DNA. Další výhodou je možnost stanovení bakteriálních druhů z neživotaschopných bakterií pomocí multiplexních PCR. Většina těchto multiplexních PCR však prokázala omezenou citlivost, i když také nalezly klinicky relevantní patogeny, které nebyly detekovány hemokulturami. Dalším omezením je, že multiplexní PCR detekuje maximálně 95 % všech patogenů způsobujících sepsi. V nedávné publikované studii autor dospěl k závěru, že testovaná multiplexní PCR „na vzorcích plné krve“ ve spojení se současnými metodami založenými na kultivaci poskytla klinickou přidanou hodnotu. Budoucí úloha PCR a dalších molekulárních technik v klinickém prostředí vyžaduje další hodnocení.

Novou metodou, která by mohla zlepšit diagnostiku sepse a zároveň mít možnost sledovat bakteriální DNA zátěž při léčbě antibiotiky, je Droplet Digital PCR (ddPCR). Tato technika umožňuje absolutní kvantifikaci sepse způsobující patogen cílený buď na druhově specifický gen nebo gen 16S ribozomální DNA (rDNA), přítomný v několika kopiích na bakterii. Při ddPCR je vzorek rozdělen na asi 20 000 kapiček vody v oleji a ve všech dochází k PCR reakci. Po PCR se každá kapka analyzuje, aby se stanovila frakce PCR-pozitivních kapiček, která dává množství bakteriální DNA v původním vzorku. Poté lze vypočítat absolutní cílovou koncentraci templátu DNA, protože velikost kapiček je známá, a pomocí statistiky Poissonovy distribuce pro korekci více než jedné pozitivní reakce ve stejné kapce.

K identifikaci sepse způsobující sekvenování patogenu genu 16S rDNA nebo brokovnicový metagenomický přístup lze použít. V druhém případě je veškerá DNA ve vzorku sekvenována pomocí sekvenování nové generace (NGS) a patogen způsobující sepsi může být detekován a má být kvantifikován pomocí analýzy bioinformatických dat.

Během septického průběhu pacient přechází od vazodilatace k vaskulárnímu prosakování a nakonec k hypotenzi. To spolu s přidanou intravenózní tekutinou zvýší distribuční objem se změněným farmakokinetickým stavem pro přidaná antibiotika. Kromě toho je u pacientů na JIP častá snížená funkce ledvin a zvýšená clearance kreatininu během akutní fáze sepse je popisována stále častěji. Proto je obtížné předvídat optimální dávku antibiotika pro septického pacienta. Je skutečně prokázáno, že u značné části pacientů na JIP není dosaženo adekvátní expozice antibiotikům, což je spojeno s negativním klinickým výsledkem.

Dysregulovaná reakce hostitele je základním kamenem současného chápání patofyziologie sepse. Zpočátku během průběhu sepse je prozánětlivá odpověď indukována časnými aktivačními geny, včetně cytokinů spojených se zánětem: tumor nekrotizující faktor (TNF), interleukin-1 (IL-1), IL-12 a IL-18. Současně je indukována imunosuprese protizánětlivými cytokiny, tj. IL-10 a transformujícím růstovým faktorem. Předpokládá se, že narušená homeostáza prozánětlivé a protizánětlivé odpovědi je součástí dysregulované odpovědi hostitele při sepsi, ačkoli klinicky dostupné biomarkery pro její identifikaci chybí. Kromě toho regulační mediátory zapojené do tohoto procesu a asociace s bakteriální clearance během sepse potřebují další zkoumání.

Gastrointestinální trakt může být zdrojem bakterií a zhoršením septického zánětu u pacientů na JIP, pokud je narušena epiteliální bariéra. U těžce nemocných pacientů je tedy kritická neporušená gastrointestinální funkce. Neexistují žádné klinicky dostupné biomarkery gastrointestinální funkce; bylo však prokázáno, že nedávno popsané skóre akutního gastrointestinálního poškození (AGI) koreluje s nepříznivým výsledkem u pacientů na JIP.

Cílem studie je zjistit, zda bakteriální DNA v plné krvi měřená pomocí ddPCR může být použita pro hodnocení bakteriální clearance u pacientů se septickou intenzivní péčí. Aby tak učinili, vyšetřovatelé budou hledat potenciální souvislost mezi clearance bakteriální DNA a clearance bakteriémie detekované hemokulturami.

Dále je cílem prozkoumat možný vztah mezi clearance bakteriální DNA, biomarkery dysregulované odpovědi hostitele a klinickým výsledkem u septického pacienta. Výsledek se měří jako: mortalita na JIP, mortalita <28 dní, dny na JIP, změna skóre sekvenčního hodnocení orgánového selhání (SOFA), doba asistované ventilace, clearance laktátu, potřeba vazopresorů a závažnost gastrointestinálního poškození. Dále je cílem studovat vztah mezi koncentrací beta-laktamových antibiotik, tj. minimální inhibiční koncentrací pro bakterie (T>MIC) detekovanou a clearance bakteriální DNA. Shromážděný materiál také přispěje k odhalení vztahu mezi ddPCR a sekvenováním brokovnice při detekci bakterií způsobujících sepsi.