A bakteriális DNS mennyiségi meghatározása szepszisben

A véráramfertőzések által okozott szeptikus szindróma világszerte jelentős egészségügyi problémát jelent, és a halálozás vezető oka a nem szív intenzív osztályon (ICU). A szepszisre irányuló folyamatos kutatások ellenére a mortalitás 12-30% körüli marad.

Súlyos szepszisben a megfelelő antibiotikum-kezelésig eltelt idő egyértelműen a túléléshez kapcsolódik. A sürgősségi osztályon azonban kihívást jelent a klinikai megjelenés mögött meghúzódó ok azonosítása és azon betegek azonosítása, akiknek a legtöbb hasznot hozná az antibiotikus kezelés. Az antibiotikumok válogatás nélküli alkalmazása elkerülhetetlenül bakteriális rezisztenciához és elfogadhatatlan mellékhatásokhoz vezet. Ezért nagy és kielégítetlen orvosi igény van olyan új diagnosztikai műszerek kifejlesztésére, amelyek tájékoztathatják a klinikust arról, hogy kinek van szüksége antibiotikumra és kinek nem. Ezen túlmenően az ok-okozati mikroorganizmus és a betegek gyulladásos állapotának korai azonosítása javítaná a kezelésekkel kapcsolatos döntéseket és csökkentené az antibiotikumok adagolását.

Napjainkban a véráram-fertőzések (BSI) diagnosztizálásának arany standardja a vérkultúra, amelyet a fajok és a rezisztenciamintázat szabványos laboratóriumi eljárásokkal történő azonosítása követ. Ez az eljárás nagy specificitással, de alacsony érzékenységgel is társul. Az erős klinikai gyanú ellenére a negatív vértenyészet valószínű okai lehetnek a tenyészpalackokban lévő elégtelen vérmennyiség vagy a vérmintavétel előtti antibiotikum-kezelés, aminek következtében a baktériumok nem szaporodnak a palackokban.

Az elmúlt években a polimeráz láncreakciót (PCR) javasolták a bakteriális DNS meghatározásának módszereként, amely a bakteriális riboszomális RNS specifikus alegységeinek (16S és 18S) amplifikációján alapul. A PCR nagyon kis mennyiségű DNS-t igényel. Egy másik előny a baktériumfajok nem életképes baktériumokból történő meghatározásának lehetősége multiplex PCR-rel. A legtöbb multiplex PCR azonban korlátozott érzékenységet mutatott, annak ellenére, hogy olyan klinikailag releváns kórokozókat is találtak, amelyeket nem mutattak ki vértenyészetekkel. Egy másik korlátozás az, hogy a multiplex-PCR az összes szepszist okozó kórokozó legfeljebb 95%-át képes kimutatni. Egy nemrégiben publikált tanulmányban a szerző arra a következtetésre jutott, hogy a "teljes vérmintákon" tesztelt multiplex PCR a jelenlegi tenyészet alapú módszerek mellett klinikai hozzáadott értéket jelent. A PCR és más molekuláris technikák jövőbeni szerepe a klinikai környezetben további értékelést igényel.

Egy új módszer, amely javíthatja a szepszis diagnosztikáját és lehetőséget ad a bakteriális DNS terhelés követésére az antibiotikum kezelés során, a Droplet Digital PCR (ddPCR). Ez a technika lehetővé teszi a szepszist okozó kórokozó abszolút mennyiségi meghatározását, amely egy fajspecifikus gént vagy a 16S riboszomális DNS (rDNS) gént célozza meg, amely baktériumonként több kópiában van jelen. A ddPCR során a minta körülbelül 20.000 víz-az-olajban cseppre oszlik, és mindegyikben a PCR-reakció játszódik le. A PCR-t követően minden cseppet elemeznek, hogy meghatározzák a PCR-pozitív cseppek frakcióját, amely megadja a bakteriális DNS mennyiségét az eredeti mintában. Ezután kiszámítható az abszolút cél DNS-templát koncentráció, mivel a cseppek mérete ismert, és Poisson-eloszlási statisztikát használva egynél több pozitív reakció korrekciójára ugyanabban a cseppben.

A szepszist okozó kórokozó azonosítására a 16S rDNS gén szekvenálása vagy shotgun metagenomikai megközelítés alkalmazható. Utóbbiban a mintában lévő összes DNS-t Next Generation Sequencing (NGS) segítségével szekvenálják, és a szepszist okozó kórokozó kimutatható és bioinformatikai adatelemzéssel számszerűsíthető.

A szeptikus kúra során a beteg az értágulattól az érrendszeri szivárgásig és végül hipotenzióig terjed. Ez a hozzáadott intravénás folyadékkezeléssel együtt növeli az eloszlási térfogatot, és megváltozik a hozzáadott antibiotikumok farmakokinetikai állapota. Ezen túlmenően a csökkent vesefunkció gyakori az intenzív osztályos betegeknél, és egyre gyakrabban írnak le megnövekedett kreatinin-clearance-t a szepszis akut fázisában. Ezért nehéz megjósolni az optimális antibiotikum adagot a szeptikus beteg számára. Valójában kimutatták, hogy az intenzív osztályos betegek jelentős részében nem érhető el megfelelő antibiotikum-expozíció, és ez negatív klinikai eredménnyel jár.

A szabályozatlan gazdaválasz a szepszis patofiziológiájának jelenlegi megértésének sarokköve. Kezdetben a szepszis lefolyása során proinflammatorikus választ indukálnak a korai aktivációs gének, köztük a gyulladással összefüggő citokinek: tumor nekrózis faktor (TNF), interleukin-1 (IL-1), IL-12 és IL-18. Ezzel egyidejűleg immunszuppressziót indukálnak a gyulladásgátló citokinek, azaz az IL-10 és a transzformáló növekedési faktor. Feltételezhető, hogy a pro- és gyulladásgátló válasz megzavart homeosztázisa a szepszisben a szabályozatlan gazdaválasz része, bár ennek azonosításához hiányoznak a klinikailag elérhető biomarkerek. Továbbá, az ebben a folyamatban részt vevő szabályozó mediátorok és a szepszis során a bakteriális kiürüléssel való kapcsolat további vizsgálatot igényel.

A gyomor-bél traktus baktériumok forrása lehet, és súlyosbíthatja a szeptikus gyulladást intenzív osztályos betegeknél, ha a hám gát megszakad. Így az ép gyomor-bélrendszeri működés kritikus fontosságú a súlyosan beteg betegeknél. Nincsenek klinikailag elérhető biomarkerek a gyomor-bélrendszer működésére vonatkozóan; azonban a közelmúltban leírt akut gastrointestinalis károsodás (AGI) pontszám korrelál az intenzív osztályos betegek káros kimenetelével.

A tanulmány célja annak vizsgálata, hogy a ddPCR-rel mért teljes vérben lévő bakteriális DNS felhasználható-e a bakteriális clearance értékelésére szeptikus intenzív terápiás betegeknél. Ennek érdekében a kutatók potenciális összefüggést keresnek a bakteriális DNS-tisztulás és a vértenyészetekkel kimutatott bakteriémia kiürülése között.

Továbbá a cél az, hogy megvizsgáljuk a bakteriális DNS kiürülése, a szabályozatlan gazdaválasz biomarkerei és a szeptikus beteg klinikai kimenetele közötti lehetséges összefüggést. Az eredményt a következőképpen mérik: mortalitás az intenzív osztályon, mortalitás <28 nap, napok az intenzív osztályon, változás a szekvenciális szervi elégtelenség értékelési pontszámában (SOFA), az asszisztált lélegeztetésben eltöltött idő, a laktát kiürülése, a vazopresszorok szükségessége és a gyomor-bélrendszeri sérülés súlyossága. A cél továbbá a béta-laktám antibiotikumok koncentrációja, azaz a kimutatott baktériumok minimális gátló koncentrációja (T>MIC) és a bakteriális DNS kiürülése közötti kapcsolat tanulmányozása. Az összegyűjtött anyag hozzájárul a ddPCR és a sörétes szekvenálás közötti kapcsolat feltárásához is a szepszist okozó baktériumok kimutatásában.