Kwantyfikacja bakteryjnego DNA w sepsie

Zespół septyczny spowodowany infekcjami krwi stanowi poważny problem zdrowotny na całym świecie i jest główną przyczyną śmiertelności na niekardiologicznych oddziałach intensywnej terapii (OIOM). Pomimo ciągłych wysiłków badawczych w sepsie, śmiertelność pozostaje tak wysoka, jak 12-30%.

W ciężkiej sepsie czas do odpowiedniej antybiotykoterapii jest wyraźnie powiązany z przeżyciem. Jednak w izbie przyjęć trudno jest zidentyfikować przyczynę obrazu klinicznego i zidentyfikować pacjentów, którzy odnieśliby największe korzyści z leczenia antybiotykami. Bezkrytyczne stosowanie antybiotyków nieuchronnie prowadzi do oporności bakterii i niedopuszczalnych zdarzeń niepożądanych. Istnieje zatem wielka i niezaspokojona potrzeba medyczna opracowania nowych narzędzi diagnostycznych, które mogłyby informować klinicystę o tym, kto będzie potrzebował antybiotyków, a kto nie odniesie z nich korzyści. Ponadto wczesna identyfikacja mikroorganizmu sprawczego i stanu zapalnego pacjentów poprawiłaby decyzje dotyczące leczenia i ograniczyłaby podawanie antybiotyków.

Obecnie złotym standardem w diagnostyce zakażeń krwi (BSI) jest posiew krwi, po którym następuje identyfikacja gatunku i wzorca oporności za pomocą standardowych procedur laboratoryjnych. Procedura ta wiąże się z wysoką specyficznością, ale także niską czułością. Prawdopodobnymi przyczynami ujemnego wyniku posiewu krwi, pomimo silnego podejrzenia klinicznego, może być niewystarczająca objętość krwi w butelkach do hodowli lub leczenie antybiotykami przed pobraniem krwi, a następnie brak wzrostu bakterii w butelkach.

W ostatnich latach zaproponowano reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) jako metodę oznaczania bakteryjnego DNA opartą na amplifikacji określonych podjednostek (16S i 18S) bakteryjnego rybosomalnego RNA. PCR wymaga bardzo małej ilości DNA. Kolejną zaletą jest możliwość określenia gatunków bakterii z bakterii nieżywotnych za pomocą multipleksowych reakcji PCR. Jednak większość z tych multipleksowych PCR wykazała ograniczoną czułość, mimo że wykryły również istotne klinicznie patogeny, których nie wykryto w posiewach krwi. Innym ograniczeniem jest to, że multipleks-PCR wykrywa maksymalnie 95% wszystkich patogenów powodujących posocznicę. W niedawno opublikowanym badaniu autor doszedł do wniosku, że przetestowany multipleksowy PCR „na próbkach krwi pełnej” w połączeniu z obecnymi metodami opartymi na hodowli zapewnia kliniczną wartość dodaną. Przyszła rola PCR i innych technik molekularnych w warunkach klinicznych wymaga dalszej oceny.

Nową metodą, która mogłaby poprawić diagnostykę sepsy, a także mieć możliwość śledzenia ładunku bakteryjnego DNA podczas antybiotykoterapii, jest Droplet Digital PCR (ddPCR). Technika ta umożliwia bezwzględną ocenę ilościową patogenu wywołującego posocznicę, którego celem jest albo gen specyficzny dla gatunku, albo gen 16S rybosomalnego DNA (rDNA), obecny w kilku kopiach na bakterię. W ddPCR próbka jest dzielona na około 20 000 kropel wody w oleju i we wszystkich z nich zachodzi reakcja PCR. Po reakcji PCR każda kropla jest analizowana w celu określenia frakcji kropelek PCR-dodatnich, co daje ilość bakteryjnego DNA w oryginalnej próbce. Następnie można obliczyć bezwzględne stężenie docelowej matrycy DNA, ponieważ znana jest wielkość kropelek, i stosując statystykę rozkładu Poissona do korekty więcej niż jednej pozytywnej reakcji w tej samej kropli.

Aby zidentyfikować posocznicę powodującą patogen, można zastosować sekwencjonowanie genu 16S rDNA lub metodę metagenomiki strzelby. W tym drugim przypadku cały DNA w próbce jest sekwencjonowany przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji (NGS), a patogen wywołujący sepsę można zarówno wykryć, jak i określić ilościowo za pomocą analizy danych bioinformatycznych.

W przebiegu septycznym pacjent przechodzi od rozszerzenia naczyń do przecieku naczyniowego, aw końcu do niedociśnienia. To wraz z dodatkowym leczeniem płynami dożylnymi zwiększy objętość dystrybucji ze zmienionym stanem farmakokinetycznym dla dodanych antybiotyków. Ponadto u pacjentów OIOM często występuje upośledzona czynność nerek, a zwiększony klirens kreatyniny w ostrej fazie posocznicy jest opisywany coraz częściej. Dlatego trudno jest przewidzieć optymalną dawkę antybiotyku dla pacjenta z sepsą. Wykazano bowiem, że u znacznej części pacjentów przebywających na OIT nie osiąga się odpowiedniej ekspozycji na antybiotyki, co wiąże się z negatywnym wynikiem klinicznym.

Rozregulowana odpowiedź gospodarza jest kamieniem węgielnym obecnego rozumienia patofizjologii sepsy. Początkowo w przebiegu sepsy odpowiedź prozapalna jest indukowana przez geny wczesnej aktywacji, w tym cytokiny związane ze stanem zapalnym: czynnik martwicy nowotworów (TNF), interleukina-1 (IL-1), IL-12 i IL-18. Jednocześnie immunosupresja jest indukowana przez cytokiny przeciwzapalne tj. IL-10 i transformujący czynnik wzrostu. Sugeruje się, że zakłócona homeostaza odpowiedzi pro- i przeciwzapalnej jest częścią rozregulowanej odpowiedzi gospodarza w sepsie, chociaż brakuje klinicznie dostępnych biomarkerów do jej identyfikacji. Ponadto mediatory regulacyjne zaangażowane w ten proces i związek z klirensem bakteryjnym podczas sepsy wymagają dalszych badań.

Przewód pokarmowy może być źródłem bakterii i nasilenia zapalenia septycznego u pacjentów OIT w przypadku przerwania bariery nabłonkowej. Tak więc nienaruszona funkcja żołądkowo-jelitowa ma kluczowe znaczenie u ciężko chorych pacjentów. Nie ma klinicznie dostępnych biomarkerów funkcji przewodu pokarmowego; jednakże wykazano, że niedawno opisana punktacja ostrego uszkodzenia przewodu pokarmowego (AGI) koreluje z niepożądanymi wynikami u pacjentów przebywających na OIOM-ie.

Celem pracy jest zbadanie, czy bakteryjne DNA z krwi pełnej mierzone metodą ddPCR może być wykorzystane do oceny klirensu bakteryjnego u pacjentów z sepsą intensywną terapią. W tym celu badacze będą szukać potencjalnego związku między klirensem bakteryjnego DNA a klirensem bakteriemii wykrytej w posiewach krwi.

Ponadto celem jest zbadanie możliwego związku między klirensem bakteryjnego DNA, biomarkerami rozregulowanej odpowiedzi gospodarza a wynikiem klinicznym u pacjenta z sepsą. Wynik jest mierzony jako: śmiertelność na OIOM, śmiertelność <28 dni, dni na OIOM, zmiana w skali SOFA, czas wentylacji wspomaganej, klirens mleczanów, zapotrzebowanie na leki wazopresyjne i ciężkość uszkodzenia przewodu pokarmowego. Ponadto celem jest zbadanie zależności między stężeniem antybiotyków beta-laktamowych, tj. minimalnym stężeniem hamującym dla wykrytych bakterii (T>MIC) a klirensem bakteryjnego DNA. Zebrany materiał przyczyni się również do ujawnienia związku między ddPCR a sekwencjonowaniem z pistoletu w wykrywaniu bakterii powodujących posocznicę.