Quantification de l'ADN bactérien dans le sepsis

Le syndrome septique causé par des infections du sang représente un problème de santé majeur dans le monde et est la principale cause de mortalité dans les unités de soins intensifs non cardiaques (USI). Malgré les efforts de recherche en cours sur la septicémie, la mortalité reste aussi élevée que 12 à 30 %.

Dans le sepsis sévère, le temps nécessaire à une antibiothérapie adéquate a été clairement lié à la survie. Cependant, aux urgences, il est difficile d'identifier la cause derrière la présentation clinique et d'identifier les patients qui bénéficieraient le plus d'un traitement antibiotique. Une utilisation inconsidérée d'antibiotiques conduit inévitablement à une résistance bactérienne et à des événements indésirables inacceptables. Ainsi, il existe un besoin médical important et non satisfait de développer de nouveaux instruments de diagnostic qui pourraient informer le clinicien sur qui aurait besoin d'antibiotiques et qui n'en bénéficierait pas. De plus, l'identification précoce du micro-organisme causal et de l'état inflammatoire des patients améliorerait les décisions concernant les traitements et réduirait l'administration d'antibiotiques.

Aujourd'hui, l'étalon-or pour le diagnostic des infections du sang (BSI) est l'hémoculture suivie de l'identification des espèces et du profil de résistance par des procédures de laboratoire standard. Cette procédure est associée à une grande spécificité mais aussi à une faible sensibilité. Les raisons probables d'une hémoculture négative malgré une forte suspicion clinique pourraient être un volume sanguin insuffisant dans les flacons de culture ou un traitement antibiotique avant le prélèvement sanguin avec un échec ultérieur de la croissance des bactéries dans les flacons.

Ces dernières années, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été proposée comme méthode pour déterminer l'ADN bactérien basée sur l'amplification de sous-unités spécifiques (16S et 18S) de l'ARN ribosomal bactérien. La PCR nécessite une très petite quantité d'ADN. Un autre avantage est la possibilité de déterminer des espèces bactériennes à partir de bactéries non viables par PCR multiplex. Cependant, la plupart de ces PCR multiplex ont montré une sensibilité limitée même si elles ont également trouvé des agents pathogènes cliniquement pertinents qui n'ont pas été détectés avec des hémocultures. Une autre limitation est que la PCR multiplex ne détecte qu'au maximum 95 % de tous les agents pathogènes responsables de la septicémie. Dans une étude publiée récemment, l'auteur a conclu qu'une PCR multiplex testée "sur des échantillons de sang total" en complément des méthodes actuelles basées sur la culture offrait une valeur ajoutée clinique. Le rôle futur de la PCR et d'autres techniques moléculaires dans le cadre clinique nécessite une évaluation plus approfondie.

Une nouvelle méthode qui pourrait améliorer le diagnostic du sepsis et avoir également la possibilité de suivre la charge d'ADN bactérien pendant le traitement antibiotique est la Droplet Digital PCR (ddPCR). Cette technique permet une quantification absolue de l'agent pathogène responsable de la septicémie ciblant soit un gène spécifique à l'espèce, soit le gène de l'ADN ribosomique 16S (ADNr), présent en plusieurs copies par bactérie. Dans la ddPCR, l'échantillon est divisé en environ 20 000 gouttelettes d'eau dans l'huile, et dans chacune d'elles, la réaction PCR se produit. Après la PCR, chaque gouttelette est analysée pour déterminer la fraction de gouttelettes positives à la PCR donnant la quantité d'ADN bactérien dans l'échantillon d'origine. La concentration absolue de la matrice d'ADN cible peut alors être calculée, puisque la taille des gouttelettes est connue, et en utilisant les statistiques de distribution de Poisson pour la correction de plus d'une réaction positive dans la même gouttelette.

Pour identifier la septicémie causant le séquençage de l'agent pathogène du gène de l'ADNr 16S ou une approche de métagénomique shotgun pourrait être utilisée. Dans ce dernier cas, tout l'ADN d'un échantillon est séquencé à l'aide du séquençage de nouvelle génération (NGS) et l'agent pathogène responsable de la septicémie peut être à la fois détecté et vise à être quantifié grâce à l'analyse des données bioinformatiques.

Au cours de l'évolution septique le patient passe d'une vasodilatation à une fuite vasculaire et enfin à une hypotension. Ceci, associé à un traitement par fluide intraveineux ajouté, augmentera le volume de distribution avec un état pharmacocinétique modifié pour les antibiotiques ajoutés. De plus, une diminution de la fonction rénale est courante chez les patients en soins intensifs et une augmentation de la clairance de la créatinine pendant la phase aiguë de la septicémie est décrite avec une fréquence croissante. Il est donc difficile d'anticiper la dose optimale d'antibiotique pour le patient septique. En effet, il est démontré que chez une partie considérable des patients en soins intensifs, une exposition adéquate aux antibiotiques n'est pas atteinte, ce qui est associé à des résultats cliniques négatifs.

Une réponse dérégulée de l'hôte est la pierre angulaire de la compréhension actuelle de la physiopathologie du sepsis. Initialement au cours de l'évolution de la septicémie, une réponse pro-inflammatoire est induite par des gènes d'activation précoce, notamment des cytokines associées à l'inflammation : facteur de nécrose tumorale (TNF), interleukine-1 (IL-1), IL-12 et IL-18. Simultanément, une suppression immunitaire est induite par des cytokines anti-inflammatoires, c'est-à-dire l'IL-10 et le facteur de croissance transformant. Une homéostasie perturbée de la réponse pro- et anti-inflammatoire est suggérée comme faisant partie de la réponse dérégulée de l'hôte dans le sepsis, bien que les biomarqueurs cliniquement disponibles pour son identification fassent défaut. En outre, les médiateurs régulateurs impliqués dans ce processus et l'association à la clairance bactérienne au cours de la septicémie nécessitent une enquête plus approfondie.

Le tractus gastro-intestinal peut être une source de bactéries et une aggravation de l'inflammation septique chez les patients en soins intensifs, si la barrière épithéliale est perturbée. Ainsi, une fonction gastro-intestinale intacte est essentielle chez les patients gravement malades. Il n'y a pas de biomarqueurs cliniquement disponibles de la fonction gastro-intestinale ; cependant, il a été démontré que le score de lésion gastro-intestinale aiguë (AGI) récemment décrit est corrélé aux résultats indésirables chez les patients en soins intensifs.

Le but de l'étude est de déterminer si l'ADN bactérien dans le sang total mesuré par ddPCR peut être utilisé pour l'évaluation de la clairance bactérienne chez les patients septiques en soins intensifs. Pour ce faire, les chercheurs rechercheront une association potentielle entre la clairance de l'ADN bactérien et la clairance de la bactériémie détectée par les hémocultures.

En outre, l'objectif est d'examiner une relation possible entre la clairance de l'ADN bactérien, les biomarqueurs de la réponse dérégulée de l'hôte et les résultats cliniques chez le patient septique. Le résultat est mesuré comme suit : mortalité en soins intensifs, mortalité <28 jours, jours en soins intensifs, modification du score d'évaluation séquentielle des défaillances d'organes (SOFA), durée de la ventilation assistée, clairance du lactate, besoin de vasopresseurs et gravité des lésions gastro-intestinales. En outre, l'objectif est d'étudier la relation entre la concentration d'antibiotiques bêta-lactamines, c'est-à-dire la concentration minimale inhibitrice pour les bactéries (T> MIC) détectée et la clairance de l'ADN bactérien. Le matériel collecté contribuera également à révéler la relation entre la ddPCR et le séquençage du fusil de chasse dans la détection des bactéries responsables de la septicémie.