Kvantificering af bakterielt DNA i sepsis

Septisk syndrom forårsaget af infektioner i blodbanen repræsenterer et stort sundhedsproblem på verdensplan og er den førende årsag til dødelighed på den ikke-hjerteintensive afdeling (ICU). På trods af en igangværende forskningsindsats i sepsis er dødeligheden fortsat så høj som 12-30 %.

Ved svær sepsis har tiden til tilstrækkelig antibiotikabehandling været klart forbundet med overlevelse. Men på skadestuen er det udfordrende at identificere årsagen bag den kliniske præsentation og identificere patienter, som ville have størst gavn af antibiotikabehandling. En vilkårlig brug af antibiotika fører uundgåeligt til bakteriel resistens og uacceptable bivirkninger. Der er således et stort og udækket medicinsk behov for at udvikle nye diagnostiske instrumenter, der kan informere klinikeren om, hvem der har brug for antibiotika, og hvem der ikke vil have gavn af det. Desuden ville tidlig identifikation af den kausale mikroorganisme og patienternes inflammatoriske status forbedre beslutninger om behandlinger og reducere administration af antibiotika.

I dag er guldstandarden for diagnosticering af blodbaneinfektioner (BSI) blodkultur efterfulgt af identifikation af arter og resistensmønster ved standard laboratorieprocedurer. Denne procedure er forbundet med en høj specificitet, men også med en lav sensitivitet. Sandsynlige årsager til en negativ bloddyrkning på trods af en stærk klinisk mistanke kan være utilstrækkelig blodvolumen i dyrkningsflaskerne eller antibiotikabehandling forud for blodprøvetagning med efterfølgende manglende vækst af bakterierne i flaskerne.

I de senere år er polymerasekædereaktion (PCR) blevet foreslået som en metode til at bestemme bakterielt DNA baseret på amplifikation af specifikke underenheder (16S og 18S) af bakterielt ribosomalt RNA. PCR kræver en meget lille mængde DNA. En anden fordel er muligheden for at bestemme bakteriearter fra ikke-levedygtige bakterier ved multiplekse PCR'er. Imidlertid har de fleste af disse multiplekse PCR'er vist en begrænset følsomhed, selvom de også fandt klinisk relevante patogener, som ikke blev påvist med blodkulturer. En anden begrænsning er, at multiplex-PCR kun detekterer maksimalt 95 % af alle sepsis-forårsagede patogener. I en nylig offentliggjort undersøgelse konkluderede forfatteren, at en testet multiplex PCR "på fuldblodsprøver" i tillæg til de nuværende kulturbaserede metoder gav en klinisk tilføjelsesværdi. Den fremtidige rolle for PCR og andre molekylære teknikker i det kliniske miljø kræver yderligere evaluering.

En ny metode, der kunne forbedre diagnostikken af ​​sepsis og også have mulighed for at følge den bakterielle DNA-belastning under antibiotikabehandling, er Droplet Digital PCR (ddPCR). Denne teknik muliggør en absolut kvantificering af den sepsis, der forårsager patogen, der er målrettet enten mod et artsspecifikt gen eller 16S ribosomalt DNA (rDNA) genet, til stede i flere kopier pr. bakterie. I ddPCR opdeles prøven i ca. 20.000 vand-i-olie-dråber, og i dem alle sker PCR-reaktionen. Efter PCR analyseres hver dråbe for at bestemme fraktionen af ​​PCR-positive dråber, der giver mængden af ​​bakterielt DNA i den originale prøve. Den absolutte mål-DNA-skabelonkoncentration kan derefter beregnes, da størrelsen af ​​dråberne er kendt, og ved at bruge Poisson-fordelingsstatistik til korrektion af mere end én positiv reaktion i samme dråbe.

For at identificere sepsis forårsager patogen sekventering af 16S rDNA genet eller en haglgevær metagenomics tilgang kunne bruges. I sidstnævnte sekventeres alt DNA i en prøve ved hjælp af Next Generation Sequencing (NGS), og det sepsisfremkaldende patogen kan både påvises og sigter mod at blive kvantificeret gennem bioinformatik dataanalyse.

Under det septiske forløb går patienten fra vasodilatation til vaskulær lækage og til sidst en hypotension. Dette sammen med tilsat intravenøs væskebehandling vil øge distributionsvolumenet med en ændret farmakokinetisk tilstand for tilsat antibiotika. Desuden er nedsat nyrefunktion almindelig hos ICU-patienter, og øget kreatininclearance under den akutte fase af sepsis beskrives med stigende frekvens. Derfor er det svært at forudse den optimale antibiotikadosis for den septiske patient. Det er faktisk vist, at en betydelig del af ICU-patienter ikke opnår en tilstrækkelig antibiotikaeksponering, og dette er forbundet med negativt klinisk resultat.

En dysreguleret værtsrespons er en hjørnesten i den nuværende forståelse af sepsis patofysiologi. Indledningsvis under sepsisforløbet induceres et proinflammatorisk respons af tidlige aktiveringsgener, herunder cytokiner forbundet med inflammation: tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin-1(IL-1), IL-12 og IL-18. Samtidig induceres en immunsuppression af anti-inflammatoriske cytokiner, dvs. IL-10 og transformerende vækstfaktor. En forstyrret homeostase af det pro- og antiinflammatoriske respons foreslås at være en del af det dysregulerede værtsrespons i sepsis, selvom klinisk tilgængelige biomarkører til dets identifikation mangler. Desuden skal de regulatoriske mediatorer, der er involveret i denne proces og sammenhængen til bakteriel clearance under sepsis, yderligere undersøgelse.

Mave-tarmkanalen kan være en kilde til bakterier og en forværring af den septiske inflammation hos ICU-patienter, hvis epitelbarrieren er forstyrret. Derfor er intakt mave-tarmfunktion kritisk hos alvorligt syge patienter. Der er ingen klinisk tilgængelige biomarkører for mave-tarmfunktion; Imidlertid har den nyligt beskrevne score for akut gastrointestinal skade (AGI) vist sig at korrelere med uønskede resultater hos ICU-patienter.

Formålet med studiet er at undersøge, om bakterielt DNA i fuldblod målt med ddPCR kan bruges til vurdering af bakteriel clearance hos septiske intensivpatienter. For at gøre dette vil efterforskerne søge efter en potentiel sammenhæng mellem bakteriel DNA-clearance og clearance af bakteriæmi påvist af blodkulturer.

Formålet er endvidere at undersøge en mulig sammenhæng mellem clearance af bakterielt DNA, biomarkører for dysreguleret værtsrespons og klinisk udfald hos den septiske patient. Resultatet måles som: dødelighed på ICU, dødelighed <28 dage, dage på ICU, ændring i Sequential Organ Failure Assessment-score (SOFA), tid i assisteret ventilation, laktatclearance, behov for vasopressorer og sværhedsgraden af ​​gastrointestinal skade. Endvidere er formålet at studere sammenhængen mellem koncentrationen af ​​beta-lactam antibiotika, dvs. den minimale hæmmende koncentration for de påviste bakterier (T>MIC) og clearance af bakterielt DNA. Det indsamlede materiale vil også bidrage til at afsløre forholdet mellem ddPCR og shot gun-sekventering ved påvisning af sepsis-forårsagende bakterier.