Kvantifiering av bakteriellt DNA i sepsis

Septiskt syndrom orsakat av blodomloppsinfektioner representerar ett stort sjukvårdsproblem över hela världen och är den främsta dödsorsaken på intensivvårdsavdelningen för icke-hjärtat (ICU). Trots pågående forskningsinsatser inom sepsis är dödligheten fortfarande så hög som 12-30%.

Vid svår sepsis har tiden till adekvat antibiotikabehandling varit tydligt kopplad till överlevnad. Men på akuten är det utmanande att identifiera orsaken bakom den kliniska presentationen och identifiera patienter som skulle ha mest nytta av antibiotikabehandling. En urskillningslös användning av antibiotika leder oundvikligen till bakteriell resistens och oacceptabla biverkningar. Det finns alltså ett stort och otillfredsställt medicinskt behov av att utveckla nya diagnostiska instrument som kan informera läkaren om vem som skulle behöva antibiotika och vem som inte skulle ha nytta av det. Vidare skulle tidig identifiering av den kausala mikroorganismen och patienternas inflammatoriska status förbättra besluten om behandlingar och minska administreringen av antibiotika.

Idag är guldstandarden för diagnos av blodomloppsinfektioner (BSI) blododling följt av identifiering av arter och resistensmönster genom standardlaboratorieprocedurer. Denna procedur är förknippad med en hög specificitet men också med en låg sensitivitet. Troliga orsaker till en negativ blododling trots en stark klinisk misstanke kan vara otillräcklig blodvolym i odlingsflaskorna eller antibiotikabehandling inför blodprovstagning med efterföljande misslyckande för bakterierna att växa i flaskorna.

På senare år har polymeraskedjereaktion (PCR) föreslagits som en metod för att bestämma bakteriellt DNA baserat på amplifiering av specifika subenheter (16S och 18S) av bakteriellt ribosomalt RNA. PCR kräver mycket liten mängd DNA. En annan fördel är möjligheten att bestämma bakteriearter från icke-viabla bakterier genom multiplexa PCR. De flesta av dessa multiplexa PCR har dock visat en begränsad känslighet även om de också hittat kliniskt relevanta patogener som inte upptäckts med blodkulturer. En annan begränsning är att multiplex-PCR endast detekterar högst 95 % av alla patogener som orsakar sepsis. I en nyligen publicerad studie drog författaren slutsatsen att en testad multiplex PCR "på helblodsprover" i tillägg till nuvarande odlingsbaserade metoder gav ett kliniskt tilläggsvärde. Den framtida rollen för PCR och andra molekylära tekniker i den kliniska miljön behöver utvärderas ytterligare.

En ny metod som skulle kunna förbättra diagnostiken av sepsis och även ha möjlighet att följa den bakteriella DNA-belastningen under antibiotikabehandling är Droplet Digital PCR (ddPCR). Denna teknik möjliggör en absolut kvantifiering av den sepsis-orsakande patogenen riktad mot antingen en artspecifik gen eller 16S ribosomalt DNA (rDNA), som finns i flera kopior per bakterie. I ddPCR delas provet upp i cirka 20 000 vatten-i-olja-droppar, och i alla uppstår PCR-reaktionen. Efter PCR analyseras varje droppe för att bestämma andelen PCR-positiva droppar som ger mängden bakteriellt DNA i det ursprungliga provet. Den absoluta mål-DNA-mallkoncentrationen kan sedan beräknas, eftersom storleken på dropparna är känd, och genom att använda Poisson-distributionsstatistik för korrigering av mer än en positiv reaktion i samma droppe.

För att identifiera sepsis som orsakar patogen kan sekvensering av 16S rDNA-genen eller en shotgun-metagenomik användas. I den senare sekvenseras allt DNA i ett prov med hjälp av Next Generation Sequencing (NGS) och den sepsis-orsakande patogenen kan både detekteras och syftar till att kvantifieras genom bioinformatisk dataanalys.

Under det septiska förloppet går patienten från vasodilatation till vaskulärt läckage och slutligen en hypotoni. Detta tillsammans med tillsatt intravenös vätskebehandling kommer att öka distributionsvolymen med ett förändrat farmakokinetiskt tillstånd för tillsatt antibiotika. Vidare är nedsatt njurfunktion vanligt hos intensivvårdspatienter och förstärkt kreatininclearance under den akuta fasen av sepsis beskrivs med ökande frekvens. Därför är det svårt att förutse den optimala antibiotikadosen för den septiska patienten. Det har faktiskt visat sig att en avsevärd del av intensivvårdspatienter inte uppnås en adekvat antibiotikaexponering och detta är förknippat med negativt kliniskt resultat.

Ett dysregulerat värdsvar är en hörnsten i den nuvarande förståelsen av sepsis patofysiologi. Initialt under sepsisförloppet induceras ett proinflammatoriskt svar av tidiga aktiveringsgener, inklusive cytokiner associerade med inflammation: tumörnekrosfaktor (TNF), Interleukin-1(IL-1), IL-12 och IL-18. Samtidigt induceras en immunsuppression av antiinflammatoriska cytokiner, dvs IL-10 och transformerande tillväxtfaktor. En störd homeostas av det pro- och antiinflammatoriska svaret föreslås vara en del av det dysreglerade värdsvaret vid sepsis även om kliniskt tillgängliga biomarkörer för dess identifiering saknas. Dessutom behöver de regulatoriska mediatorerna som är involverade i denna process och sambandet med bakteriell clearance under sepsis ytterligare utredning.

Mag-tarmkanalen kan vara en källa till bakterier och en förvärring av den septiska inflammationen hos intensivvårdspatienter, om epitelbarriären störs. Således är intakt mag-tarmfunktion kritisk hos svårt sjuka patienter. Det finns inga kliniskt tillgängliga biomarkörer för gastrointestinal funktion; Men det nyligen beskrivna poängen för akut gastrointestinal skada (AGI) har visat sig korrelera med ogynnsamt resultat hos ICU-patienter.

Syftet med studien är att undersöka om bakteriellt DNA i helblod mätt med ddPCR kan användas för bedömning av bakteriell clearance hos septiska intensivvårdspatienter. För att göra det kommer utredarna att söka efter ett potentiellt samband mellan bakteriell DNA-clearance och clearance av bakteriemi som upptäckts av blodkulturer.

Vidare är syftet att undersöka ett möjligt samband mellan clearance av bakteriellt DNA, biomarkörer för dysregulerat värdsvar och kliniskt utfall hos den septiska patienten. Utfallet mäts som: mortalitet på ICU, mortalitet <28 dagar, dagar på ICU, förändring i Sequential Organ Failure Assessment score (SOFA), tid i assisterad ventilation, laktatclearance, behov av vasopressorer och svårighetsgraden av gastrointestinala skador. Vidare är syftet att studera sambandet mellan koncentrationen av betalaktamantibiotika, dvs den minimala hämmande koncentrationen för de detekterade bakterierna (T>MIC) och clearance av bakteriellt DNA. Det insamlade materialet kommer också att bidra till att avslöja sambandet mellan ddPCR och hagelgevärssekvensering vid detektering av sepsis-orsakande bakterier.