Количественная оценка бактериальной ДНК при сепсисе

Септический синдром, вызванный инфекциями кровотока, представляет собой серьезную проблему здравоохранения во всем мире и является ведущей причиной смертности в несердечных отделениях интенсивной терапии (ОИТ). Несмотря на продолжающиеся исследования сепсиса, смертность остается на уровне 12-30%.

При тяжелом сепсисе время до адекватной антибактериальной терапии явно связано с выживаемостью. Однако в отделении неотложной помощи сложно определить причину клинической картины и выявить пациентов, которым лечение антибиотиками принесет наибольшую пользу. Неизбирательное использование антибиотиков неизбежно приводит к резистентности бактерий и неприемлемым побочным эффектам. Таким образом, существует большая и неудовлетворенная медицинская потребность в разработке новых диагностических инструментов, которые могли бы информировать клиницистов о том, кому потребуются антибиотики, а кому они не принесут пользы. Кроме того, раннее выявление возбудителя и воспалительного статуса у пациентов улучшило бы принятие решений о лечении и уменьшило бы применение антибиотиков.

На сегодняшний день золотым стандартом диагностики инфекций кровотока (BSI) является посев крови с последующей идентификацией видов и моделей резистентности с помощью стандартных лабораторных процедур. Эта процедура связана с высокой специфичностью, но также и с низкой чувствительностью. Вероятными причинами отрицательного результата посева крови, несмотря на сильное клиническое подозрение, могут быть недостаточный объем крови в культуральных флаконах или лечение антибиотиками перед забором крови с последующим прекращением роста бактерий во флаконах.

В последние годы в качестве метода определения бактериальной ДНК была предложена полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на амплификации специфических субъединиц (16S и 18S) бактериальной рибосомной РНК. Для ПЦР требуется очень небольшое количество ДНК. Еще одним преимуществом является возможность определения видов бактерий из нежизнеспособных бактерий с помощью мультиплексной ПЦР. Однако большинство этих мультиплексных ПЦР показали ограниченную чувствительность, даже несмотря на то, что они также обнаружили клинически значимые патогены, которые не были обнаружены с помощью культур крови. Другое ограничение заключается в том, что мультиплексная ПЦР выявляет максимум 95% всех возбудителей сепсиса. В недавнем опубликованном исследовании автор пришел к выводу, что проверенная мультиплексная ПЦР «на образцах цельной крови» в дополнение к существующим культуральным методам обеспечивает клиническую дополнительную ценность. Будущая роль ПЦР и других молекулярных методов в клинических условиях нуждается в дальнейшей оценке.

Новым методом, который может улучшить диагностику сепсиса, а также дает возможность отслеживать бактериальную ДНК-нагрузку во время лечения антибиотиками, является капельная цифровая ПЦР (ddPCR). Этот метод позволяет провести абсолютную количественную оценку патогена, вызывающего сепсис, нацеленного либо на видоспецифический ген, либо на ген 16S рибосомной ДНК (рДНК), присутствующий в нескольких копиях на бактерию. В ddPCR образец делится примерно на 20 000 капель воды в масле, и во всех из них происходит ПЦР-реакция. После ПЦР каждую каплю анализируют для определения доли ПЦР-положительных капель, что дает количество бактериальной ДНК в исходном образце. Затем можно рассчитать абсолютную концентрацию ДНК-матрицы мишени, поскольку размер капель известен, и с помощью статистики распределения Пуассона для коррекции более чем одной положительной реакции в одной и той же капле.

Для идентификации патогена, вызывающего сепсис, можно использовать секвенирование гена рДНК 16S или метод метагеномики дробовика. В последнем случае вся ДНК в образце секвенируется с использованием секвенирования следующего поколения (NGS), и патоген, вызывающий сепсис, может быть как обнаружен, так и определен количественно с помощью анализа данных биоинформатики.

При септическом течении у больного переходят от вазодилатации к сосудистой утечке и, наконец, к гипотонии. Это вместе с добавлением внутривенного введения жидкости увеличит объем распределения с измененным фармакокинетическим состоянием для добавленных антибиотиков. Кроме того, у пациентов в ОИТ часто наблюдается снижение функции почек, а повышенный клиренс креатинина в острой фазе сепсиса описывается все чаще. Поэтому трудно предугадать оптимальную дозу антибиотика для больного с сепсисом. Действительно, показано, что у значительной части пациентов ОИТ адекватная экспозиция антибиотиков не достигается, что связано с отрицательным клиническим исходом.

Нерегулируемый ответ хозяина является краеугольным камнем современного понимания патофизиологии сепсиса. Первоначально при течении сепсиса провоспалительный ответ индуцируется генами ранней активации, в том числе ассоциированными с воспалением цитокинами: фактором некроза опухоли (ФНО), интерлейкином-1 (ИЛ-1), ИЛ-12 и ИЛ-18. Одновременно иммунная супрессия индуцируется противовоспалительными цитокинами, т.е. ИЛ-10 и трансформирующим фактором роста. Предполагается, что нарушение гомеостаза про- и противовоспалительного ответа является частью нерегулируемого ответа хозяина при сепсисе, хотя клинически доступные биомаркеры для его идентификации отсутствуют. Кроме того, регуляторные медиаторы, участвующие в этом процессе, и связь с клиренсом бактерий при сепсисе требуют дальнейшего изучения.

Желудочно-кишечный тракт может быть источником бактерий и обострения септического воспаления у пациентов ОИТ, если эпителиальный барьер нарушен. Таким образом, сохранная функция желудочно-кишечного тракта имеет решающее значение для пациентов с тяжелыми заболеваниями. Клинически доступных биомаркеров желудочно-кишечной функции нет; однако было показано, что недавно описанная оценка острого желудочно-кишечного повреждения (AGI) коррелирует с неблагоприятным исходом у пациентов в отделении интенсивной терапии.

Цель исследования — выяснить, можно ли использовать бактериальную ДНК в цельной крови, измеренную с помощью ddPCR, для оценки бактериального клиренса у пациентов с сепсисом в отделении интенсивной терапии. Для этого исследователи будут искать потенциальную связь между клиренсом бактериальной ДНК и клиренсом бактериемии, обнаруженным культурами крови.

Кроме того, цель состоит в том, чтобы изучить возможную связь между клиренсом бактериальной ДНК, биомаркерами нерегулируемого ответа хозяина и клиническим исходом у пациента с сепсисом. Исход измеряется как: смертность в отделении интенсивной терапии, смертность <28 дней, количество дней в отделении интенсивной терапии, изменение в шкале оценки последовательной органной недостаточности (SOFA), время на вспомогательной вентиляции, клиренс лактата, потребность в вазопрессорах и тяжесть желудочно-кишечного повреждения. Кроме того, цель состоит в том, чтобы изучить взаимосвязь между концентрацией бета-лактамных антибиотиков, то есть минимальной ингибирующей концентрацией для обнаруженных бактерий (T> MIC), и клиренсом бактериальной ДНК. Собранный материал также поможет выявить взаимосвязь между ddPCR и секвенированием дробовика при обнаружении бактерий, вызывающих сепсис.