Quantifizierung bakterieller DNA bei Sepsis

Das durch Blutbahninfektionen verursachte septische Syndrom stellt weltweit ein großes Gesundheitsproblem dar und ist die häufigste Todesursache auf der nicht-kardialen Intensivstation (ICU). Trotz anhaltender Forschungsanstrengungen bei Sepsis bleibt die Sterblichkeit bei 12–30 %.

Bei schwerer Sepsis ist die Zeit bis zur adäquaten Antibiotikatherapie eindeutig mit dem Überleben verknüpft. In der Notaufnahme ist es jedoch schwierig, die Ursache hinter dem klinischen Erscheinungsbild zu identifizieren und Patienten zu identifizieren, die am meisten von einer Antibiotikabehandlung profitieren würden. Ein wahlloser Einsatz von Antibiotika führt zwangsläufig zu bakterieller Resistenz und inakzeptablen unerwünschten Ereignissen. Daher besteht ein großer und ungedeckter medizinischer Bedarf an der Entwicklung neuartiger diagnostischer Instrumente, die den Kliniker darüber informieren könnten, wer Antibiotika benötigen würde und wer nicht davon profitieren würde. Darüber hinaus würde eine frühzeitige Identifizierung des verursachenden Mikroorganismus und des Entzündungsstatus der Patienten Entscheidungen über Behandlungen verbessern und die Verabreichung von Antibiotika reduzieren.

Heutzutage ist der Goldstandard für die Diagnose von Blutstrominfektionen (BSI) eine Blutkultur, gefolgt von der Identifizierung der Spezies und des Resistenzmusters durch Standardlaborverfahren. Dieses Verfahren ist mit einer hohen Spezifität, aber auch mit einer geringen Sensitivität verbunden. Mögliche Gründe für eine negative Blutkultur trotz starkem klinischen Verdacht können ein unzureichendes Blutvolumen in den Kulturflaschen oder eine Antibiotikabehandlung vor der Blutentnahme mit nachfolgendem Wachstumsversagen der Bakterien in den Flaschen sein.

In den letzten Jahren wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Verfahren zur Bestimmung bakterieller DNA basierend auf der Amplifikation spezifischer Untereinheiten (16S und 18S) bakterieller ribosomaler RNA vorgeschlagen. PCR erfordert eine sehr kleine Menge an DNA. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, Bakterienarten von nicht lebensfähigen Bakterien durch Multiplex-PCRs zu bestimmen. Die meisten dieser Multiplex-PCRs haben jedoch eine begrenzte Sensitivität gezeigt, obwohl sie auch klinisch relevante Pathogene gefunden haben, die mit Blutkulturen nicht nachgewiesen wurden. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Multiplex-PCR nur maximal 95 % aller Sepsis-Erreger erkennt. In einer kürzlich veröffentlichten Studie kam der Autor zu dem Schluss, dass eine getestete Multiplex-PCR „an Vollblutproben“ in Ergänzung zu aktuellen kulturbasierten Methoden einen klinischen Mehrwert bietet. Die zukünftige Rolle der PCR und anderer molekularer Techniken im klinischen Umfeld muss weiter evaluiert werden.

Eine neue Methode, die die Sepsisdiagnostik verbessern könnte und auch die Möglichkeit bietet, die bakterielle DNA-Belastung während einer Antibiotikabehandlung zu verfolgen, ist die Droplet Digital PCR (ddPCR). Diese Technik ermöglicht eine absolute Quantifizierung des sepsisverursachenden Pathogens, das entweder auf ein speziesspezifisches Gen oder auf das Gen der 16S-ribosomalen DNA (rDNA) abzielt, das in mehreren Kopien pro Bakterie vorhanden ist. Bei der ddPCR wird die Probe in etwa 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen aufgeteilt, in denen die PCR-Reaktion stattfindet. Nach der PCR wird jedes Tröpfchen analysiert, um den Anteil an PCR-positiven Tröpfchen zu bestimmen, der die Menge an bakterieller DNA in der ursprünglichen Probe angibt. Die absolute Ziel-DNA-Matrizenkonzentration kann dann berechnet werden, da die Größe der Tröpfchen bekannt ist, und durch Verwendung der Poisson-Verteilungsstatistik für die Korrektur von mehr als einer positiven Reaktion in demselben Tröpfchen.

Um den sepsisverursachenden Erreger zu identifizieren, könnte eine Sequenzierung des 16S-rDNA-Gens oder ein Shotgun-Metagenomik-Ansatz verwendet werden. Bei letzterem wird die gesamte DNA in einer Probe mit Next Generation Sequencing (NGS) sequenziert und der Erreger der Sepsis kann durch bioinformatische Datenanalyse sowohl nachgewiesen als auch quantifiziert werden.

Während des septischen Verlaufs gehen die Patienten von Vasodilatation zu Gefäßleckagen und schließlich zu einer Hypotonie über. Zusammen mit der zusätzlichen Behandlung mit intravenöser Flüssigkeit erhöht dies das Verteilungsvolumen mit einem veränderten pharmakokinetischen Zustand für hinzugefügte Antibiotika. Darüber hinaus ist eine verminderte Nierenfunktion bei Intensivpatienten häufig und eine erhöhte Kreatinin-Clearance während der akuten Phase der Sepsis wird zunehmend häufiger beschrieben. Daher ist es schwierig, die optimale Antibiotikadosis für den septischen Patienten vorherzusagen. Tatsächlich zeigt sich, dass bei einem beträchtlichen Teil der Intensivpatienten keine ausreichende Antibiotika-Exposition erreicht wird und dies mit einem negativen klinischen Ergebnis verbunden ist.

Eine fehlregulierte Wirtsantwort ist ein Eckpfeiler des aktuellen Verständnisses der Sepsis-Pathophysiologie. Anfänglich während des Sepsisverlaufs wird eine proinflammatorische Reaktion durch frühe Aktivierungsgene induziert, darunter Zytokine, die mit Entzündungen assoziiert sind: Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin-1 (IL-1), IL-12 und IL-18. Gleichzeitig wird durch entzündungshemmende Zytokine, d. h. IL-10 und transformierenden Wachstumsfaktor, eine Immunsuppression induziert. Es wird vermutet, dass eine gestörte Homöostase der pro- und entzündungshemmenden Reaktion Teil der dysregulierten Wirtsantwort bei Sepsis ist, obwohl klinisch verfügbare Biomarker für ihre Identifizierung fehlen. Darüber hinaus müssen die an diesem Prozess beteiligten regulatorischen Mediatoren und die Assoziation mit der bakteriellen Clearance während der Sepsis weiter untersucht werden.

Der Gastrointestinaltrakt kann eine Quelle von Bakterien und eine Verschlechterung der septischen Entzündung bei Intensivpatienten sein, wenn die Epithelbarriere gestört ist. Daher ist eine intakte Magen-Darm-Funktion bei schwer erkrankten Patienten entscheidend. Es gibt keine klinisch verfügbaren Biomarker der Magen-Darm-Funktion; Es wurde jedoch gezeigt, dass der kürzlich beschriebene Wert für akute gastrointestinale Verletzungen (AGI) mit unerwünschten Ergebnissen bei Intensivpatienten korreliert.

Ziel der Studie ist es zu untersuchen, ob mit ddPCR gemessene bakterielle DNA im Vollblut zur Beurteilung der bakteriellen Clearance bei septischen Intensivpatienten verwendet werden kann. Dazu suchen die Forscher nach einem möglichen Zusammenhang zwischen der bakteriellen DNA-Clearance und der Clearance von durch Blutkulturen nachgewiesener Bakteriämie.

Darüber hinaus soll ein möglicher Zusammenhang zwischen der Clearance bakterieller DNA, Biomarkern einer fehlregulierten Wirtsantwort und dem klinischen Ergebnis bei septischen Patienten untersucht werden. Das Ergebnis wird gemessen als: Sterblichkeit auf der Intensivstation, Sterblichkeit < 28 Tage, Tage auf der Intensivstation, Veränderung des Sequential Organ Failure Assessment Score (SOFA), Zeit in der assistierten Beatmung, Laktatclearance, Bedarf an Vasopressoren und Schweregrad der gastrointestinalen Verletzung. Weiterhin soll die Beziehung zwischen der Konzentration von Beta-Lactam-Antibiotika, d. h. der minimalen Hemmkonzentration für die nachgewiesenen Bakterien (T>MHK), und der Clearance bakterieller DNA untersucht werden. Das gesammelte Material wird auch dazu beitragen, die Beziehung zwischen ddPCR und Shotgun-Sequenzierung beim Nachweis der sepsisverursachenden Bakterien aufzudecken.