Kvantifisering av bakteriell DNA i sepsis

Septisk syndrom forårsaket av infeksjoner i blodet representerer et stort helseproblem på verdensbasis og er den ledende årsaken til dødelighet på intensivavdelingen for ikke-hjerteavdelinger (ICU). Til tross for pågående forskningsinnsats innen sepsis, forblir dødeligheten så høy som 12-30 %.

Ved alvorlig sepsis har tiden til adekvat antibiotikabehandling vært klart knyttet til overlevelse. På legevakten er det imidlertid utfordrende å identifisere årsaken bak den kliniske presentasjonen og identifisere pasienter som vil ha mest nytte av antibiotikabehandling. En ukritisk bruk av antibiotika fører uunngåelig til bakteriell resistens og uakseptable bivirkninger. Det er derfor et stort og udekket medisinsk behov for å utvikle nye diagnostiske instrumenter som kan informere klinikeren om hvem som vil trenge antibiotika og hvem som ikke har nytte av det. Videre vil tidlig identifisering av den kausale mikroorganismen og pasientenes inflammatoriske status forbedre beslutninger om behandlinger og redusere administrering av antibiotika.

I dag er gullstandarden for diagnostisering av blodstrøminfeksjoner (BSI) blodkultur etterfulgt av identifikasjon av arter og resistensmønster ved standard laboratorieprosedyrer. Denne prosedyren er assosiert med høy spesifisitet, men også med lav sensitivitet. Sannsynlige årsaker til en negativ blodkultur til tross for sterk klinisk mistanke kan være utilstrekkelig blodvolum i dyrkingsflaskene eller antibiotikabehandling før blodprøvetaking med påfølgende svikt i vekst av bakteriene i flaskene.

De siste årene har polymerasekjedereaksjon (PCR) blitt foreslått som en metode for å bestemme bakteriell DNA basert på amplifikasjon av spesifikke underenheter (16S og 18S) av bakteriell ribosomalt RNA. PCR krever svært små mengder DNA. En annen fordel er muligheten til å bestemme bakteriearter fra ikke-levedyktige bakterier ved multiplekse PCR. Imidlertid har de fleste av disse multiplekse PCR-ene vist en begrenset følsomhet selv om de også fant klinisk relevante patogener som ikke ble oppdaget med blodkulturer. En annen begrensning er at multipleks-PCR bare oppdager maksimalt 95 % av alle sepsis-forårsakende patogener. I en nylig publisert studie konkluderte forfatteren med at en testet multipleks PCR "på fullblodsprøver" i tillegg til gjeldende kulturbaserte metoder ga en klinisk tilleggsverdi. Den fremtidige rollen til PCR og andre molekylære teknikker i den kliniske settingen trenger ytterligere evaluering.

En ny metode som kan forbedre diagnostikken av sepsis og også ha mulighet til å følge bakteriell DNA-belastning under antibiotikabehandling er Droplet Digital PCR (ddPCR). Denne teknikken muliggjør en absolutt kvantifisering av det sepsis-forårsakende patogenet rettet mot enten et artsspesifikt gen eller 16S ribosomalt DNA (rDNA)-genet, tilstede i flere kopier per bakterie. I ddPCR deles prøven inn i ca. 20.000 vann-i-olje-dråper, og i alle oppstår PCR-reaksjonen. Etter PCR analyseres hver dråpe for å bestemme andelen av PCR-positive dråper som gir mengden bakteriell DNA i den opprinnelige prøven. Den absolutte mål-DNA-templatekonsentrasjonen kan deretter beregnes, siden størrelsen på dråpene er kjent, og ved å bruke Poisson-fordelingsstatistikk for korreksjon av mer enn én positiv reaksjon i samme dråpe.

For å identifisere sepsis som forårsaker patogen kan sekvensering av 16S rDNA-genet eller en hagle metagenomikk-tilnærming brukes. I sistnevnte sekvenseres alt DNA i en prøve ved hjelp av Next Generation Sequencing (NGS), og det sepsis-forårsakende patogenet kan både oppdages og har som mål å kvantifiseres gjennom bioinformatikkdataanalyse.

I løpet av det septiske forløpet går pasienten fra vasodilatasjon til vaskulær lekkasje og til slutt en hypotensjon. Dette sammen med tilsatt intravenøs væskebehandling vil øke distribusjonsvolumet med endret farmakokinetisk tilstand for tilsatt antibiotika. Videre er nedsatt nyrefunksjon vanlig hos ICU-pasienter og økt kreatininclearance under den akutte fasen av sepsis beskrives med økende frekvens. Derfor er det vanskelig å forutse den optimale antibiotikadosen for den septiske pasienten. Det er faktisk vist at hos en betydelig del av ICU-pasienter oppnås ikke tilstrekkelig antibiotikaeksponering, og dette er assosiert med negativt klinisk resultat.

En dysregulert vertsrespons er en hjørnestein i dagens forståelse av sepsis patofysiologi. Til å begynne med under sepsisforløpet induseres en proinflammatorisk respons av tidlige aktiveringsgener, inkludert cytokiner assosiert med betennelse: tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin-1(IL-1), IL-12 og IL-18. Samtidig induseres en immunsuppresjon av antiinflammatoriske cytokiner, dvs. IL-10 og transformerende vekstfaktor. En forstyrret homeostase av den pro- og antiinflammatoriske responsen antydes å være en del av den dysregulerte vertsresponsen ved sepsis, selv om klinisk tilgjengelige biomarkører for identifisering mangler. Videre trenger de regulatoriske mediatorene som er involvert i denne prosessen og assosiasjonen til bakteriell clearance under sepsis ytterligere undersøkelser.

Mage-tarmkanalen kan være en kilde til bakterier og en forverring av septisk betennelse hos ICU-pasienter hvis epitelbarrieren er forstyrret. Intakt gastrointestinal funksjon er derfor kritisk hos alvorlig syke pasienter. Det er ingen klinisk tilgjengelige biomarkører for gastrointestinal funksjon; Imidlertid har den nylig beskrevne skåren for akutt gastrointestinal skade (AGI) vist seg å korrelere med uønsket utfall hos ICU-pasienter.

Målet med studien er å undersøke om bakteriell DNA i fullblod målt med ddPCR kan brukes for vurdering av bakteriell clearance hos septiske intensivpasienter. For å gjøre dette vil etterforskerne lete etter en potensiell sammenheng mellom bakteriell DNA-clearance og clearance av bakteriemi påvist av blodkulturer.

Videre er målet å undersøke en mulig sammenheng mellom clearance av bakterielt DNA, biomarkører for dysregulert vertsrespons og klinisk utfall hos den septiske pasienten. Utfallet måles som: dødelighet på ICU, dødelighet <28 dager, dager på ICU, endring i Sequential Organ Failure Assessment score (SOFA), tid i assistert ventilasjon, laktatclearance, behov for vasopressorer og alvorlighetsgraden av gastrointestinal skade. Videre er målet å studere forholdet mellom konsentrasjonen av betalaktamantibiotika, dvs. den minimale hemmende konsentrasjonen for de påviste bakteriene (T>MIC) og clearance av bakteriell DNA. Materialet som samles inn vil også bidra til å avsløre forholdet mellom ddPCR og shot gun-sekvensering ved påvisning av sepsis-fremkallende bakterier.