Bakteeri-DNA:n kvantifiointi sepsiksessä

Verenkierron infektioiden aiheuttama septinen oireyhtymä on merkittävä terveydenhuollon ongelma maailmanlaajuisesti ja johtava kuolinsyy ei-sydämen tehohoitoyksikössä (ICU). Huolimatta meneillään olevista sepsiksen tutkimuksista kuolleisuus on edelleen 12-30 %.

Vaikeassa sepsiksessä riittävään antibioottihoitoon kuluva aika on selvästi yhdistetty eloonjäämiseen. Päivystyspoliklinikalla on kuitenkin haastavaa tunnistaa kliinisen esityksen taustalla oleva syy ja tunnistaa potilaat, jotka hyötyisivät eniten antibioottihoidosta. Antibioottien mielivaltainen käyttö johtaa väistämättä bakteerien vastustuskykyyn ja ei-hyväksyttäviin haittatapahtumiin. Siksi on olemassa suuri ja tyydyttämätön lääketieteellinen tarve kehittää uusia diagnostisia instrumentteja, jotka voisivat kertoa kliinikolle siitä, kuka tarvitsee antibiootteja ja ketkä eivät hyötyisi niistä. Lisäksi syy-mikro-organismin ja potilaiden tulehdustilan varhainen tunnistaminen parantaisi hoitopäätöksiä ja vähentäisi antibioottien käyttöä.

Nykyään verenkiertoinfektioiden (BSI) diagnosoinnin kultastandardi on veriviljely, jota seuraa lajien ja resistenssimallin tunnistaminen tavanomaisilla laboratoriomenetelmillä. Tämä menetelmä liittyy korkeaan spesifisyyteen, mutta myös alhaiseen herkkyyteen. Todennäköiset syyt negatiiviseen veriviljelyyn vahvasta kliinisestä epäilystä huolimatta voivat olla riittämätön veritilavuus viljelypulloissa tai antibioottihoito ennen verinäytteen ottoa, minkä seurauksena bakteerit eivät kasva pulloissa.

Viime vuosina polymeraasiketjureaktiota (PCR) on ehdotettu menetelmäksi bakteeri-DNA:n määrittämiseksi, joka perustuu bakteerien ribosomaalisen RNA:n spesifisten alayksiköiden (16S ja 18S) monistumiseen. PCR vaatii hyvin pienen määrän DNA:ta. Toinen etu on mahdollisuus määrittää bakteerilajit elottomista bakteereista moninkertaisella PCR:llä. Useimmat näistä multipleksi-PCR:istä ovat kuitenkin osoittaneet rajoitettua herkkyyttä, vaikka ne löysivät myös kliinisesti merkityksellisiä patogeenejä, joita ei havaittu veriviljelmillä. Toinen rajoitus on, että multipleksi-PCR havaitsee vain enintään 95 % kaikista sepsiksen aiheuttavista taudinaiheuttajista. Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa kirjoittaja päätteli, että testattu multiplex PCR "kokoverinäytteillä" nykyisten viljelypohjaisten menetelmien lisäksi tarjosi kliinisen lisäarvon. PCR:n ja muiden molekyylitekniikoiden tuleva rooli kliinisessä ympäristössä vaatii lisäarviointia.

Uusi menetelmä, joka voisi parantaa sepsiksen diagnostiikkaa ja jolla on myös mahdollisuus seurata bakteerien DNA-kuormitusta antibioottihoidon aikana, on Droplet Digital PCR (ddPCR). Tämä tekniikka mahdollistaa sepsiksen aiheuttavan patogeenin absoluuttisen kvantifioinnin, joka kohdistuu joko lajispesifiseen geeniin tai 16S ribosomaalisen DNA:n (rDNA) geeniin, jota on useita kopioita bakteeria kohti. DdPCR:ssä näyte jaetaan noin 20 000 vesi öljyssä -pisaraan, joissa kaikissa tapahtuu PCR-reaktio. PCR:n jälkeen jokainen pisara analysoidaan sen PCR-positiivisten pisaroiden osuuden määrittämiseksi, joka antaa bakteeri-DNA:n määrän alkuperäisessä näytteessä. Absoluuttinen kohde-DNA-templaattipitoisuus voidaan sitten laskea, koska pisaroiden koko tiedetään, ja käyttämällä Poisson-jakauman tilastoja useamman kuin yhden positiivisen reaktion korjaamiseen samassa pisarassa.

Sepsiksen aiheuttavan patogeenin tunnistamiseen voidaan käyttää 16S-rDNA-geenin sekvensointia tai haulikkometagenomiikan lähestymistapaa. Jälkimmäisessä kaikki näytteen DNA sekvensoidaan Next Generation Sequencing (NGS) -menetelmällä ja sepsiksen aiheuttava patogeeni voidaan sekä havaita että kvantifioida bioinformatiikan data-analyysin avulla.

Septisen kurssin aikana potilas siirtyy verisuonten laajenemisesta verisuonivuotoon ja lopulta hypotensioon. Tämä yhdessä lisätyn suonensisäisen nestehoidon kanssa lisää jakautumistilavuutta lisättyjen antibioottien muuttuessa farmakokineettisessä tilassa. Lisäksi munuaisten toiminnan heikkeneminen on yleistä tehohoitopotilailla, ja lisääntynyttä kreatiniinipuhdistumaa sepsiksen akuutin vaiheen aikana kuvataan yhä useammin. Siksi on vaikea ennakoida optimaalista antibioottiannosta septiselle potilaalle. On todellakin osoitettu, että huomattava osa tehohoitopotilaista ei saavuta riittävää antibioottialtistusta, ja tämä liittyy negatiiviseen kliiniseen lopputulokseen.

Epäsäännelty isännän vaste on sepsiksen patofysiologian nykyisen ymmärryksen kulmakivi. Aluksi sepsiksen aikana proinflammatorisen vasteen indusoivat varhaiset aktivaatiogeenit, mukaan lukien tulehdukseen liittyvät sytokiinit: tuumorinekroositekijä (TNF), interleukiini-1 (IL-1), IL-12 ja IL-18. Samanaikaisesti anti-inflammatoriset sytokiinit eli IL-10 ja transformoiva kasvutekijä indusoivat immuunivasteen. Pro- ja anti-inflammatorisen vasteen häiriintyneen homeostaasin oletetaan olevan osa epäsäänneltyä isäntävastetta sepsiksessä, vaikka kliinisesti saatavilla olevia biomarkkereita sen tunnistamiseksi puuttuu. Lisäksi tähän prosessiin osallistuvat säätelevät välittäjät ja yhteys bakteerien puhdistumaan sepsiksen aikana vaativat lisätutkimuksia.

Ruoansulatuskanava voi olla bakteerien lähde ja septisen tulehduksen paheneminen teho-osastolla olevilla potilailla, jos epiteelin este on häiriintynyt. Näin ollen ehjä ruoansulatuskanavan toiminta on kriittinen vakavasti sairaille potilaille. Ruoansulatuskanavan toiminnalle ei ole kliinisesti saatavilla olevia biomarkkereita; kuitenkin äskettäin kuvatun akuutin gastrointestinaalisen vaurion (AGI) pistemäärän on osoitettu korreloivan teho-osastopotilaiden haittavaikutusten kanssa.

Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, voidaanko ddPCR:llä mitattua kokoveren bakteeri-DNA:ta käyttää septisen tehohoidon potilaiden bakteeripuhdistuman arvioimiseen. Tätä varten tutkijat etsivät mahdollista yhteyttä bakteerien DNA:n puhdistuman ja veriviljelmillä havaitun bakteremian puhdistuman välillä.

Lisäksi tavoitteena on tutkia mahdollista yhteyttä bakteeri-DNA:n puhdistuman, säätelemättömän isäntävasteen biomarkkerien ja kliinisen lopputuloksen välillä septisellä potilaalla. Tulos mitataan seuraavina: kuolleisuus teho-osastolla, kuolleisuus <28 päivää, päivät teho-osastolla, muutos peräkkäisen elinten vajaatoiminnan arviointipisteessä (SOFA), avustetussa ventilaatiossa käytetty aika, laktaatin puhdistuma, vasopressoreiden tarve ja maha-suolikanavan vaurion vakavuus. Lisäksi tavoitteena on tutkia beetalaktaamiantibioottien pitoisuuden eli havaitun bakteerien minimaalisen estopitoisuuden (T>MIC) ja bakteeri-DNA:n puhdistuman välistä suhdetta. Kerätty materiaali auttaa myös paljastamaan ddPCR:n ja haulikkosekvensoinnin välisen suhteen sepsiksen aiheuttavien bakteerien havaitsemisessa.