Quantificação de DNA bacteriano na sepse

A síndrome séptica causada por infecções da corrente sanguínea representa um importante problema de saúde em todo o mundo e é a principal causa de mortalidade na unidade de terapia intensiva (UTI) não cardíaca. Apesar dos esforços contínuos de pesquisa em sepse, a mortalidade permanece tão alta quanto 12-30%.

Na sepse grave, o tempo para antibioticoterapia adequada tem sido claramente associado à sobrevida. No entanto, na sala de emergência, é um desafio identificar a causa por trás da apresentação clínica e identificar os pacientes que mais se beneficiariam com o tratamento com antibióticos. O uso indiscriminado de antibióticos leva inevitavelmente à resistência bacteriana e a eventos adversos inaceitáveis. Assim, há uma grande e não atendida necessidade médica de desenvolver novos instrumentos de diagnóstico que possam informar o clínico sobre quem precisaria de antibióticos e quem não se beneficiaria com isso. Além disso, a identificação precoce do microrganismo causal e o estado inflamatório dos pacientes melhorariam as decisões sobre os tratamentos e reduziriam a administração de antibióticos.

Hoje, o padrão-ouro para o diagnóstico de infecções da corrente sanguínea (BSI) é a hemocultura seguida da identificação da espécie e do padrão de resistência por meio de procedimentos laboratoriais padrão. Este procedimento está associado a uma alta especificidade, mas também a uma baixa sensibilidade. As razões prováveis ​​para uma hemocultura negativa, apesar de uma forte suspeita clínica, podem ser volume insuficiente de sangue nos frascos de cultura ou tratamento com antibióticos antes da coleta de sangue, com subsequente falha de crescimento das bactérias nos frascos.

Nos últimos anos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi proposta como um método para determinar o DNA bacteriano baseado na amplificação de subunidades específicas (16S e 18S) do RNA ribossômico bacteriano. A PCR requer uma quantidade muito pequena de DNA. Outra vantagem é a possibilidade de determinar espécies bacterianas de bactérias não viáveis ​​por PCRs multiplex. No entanto, a maioria dessas PCRs multiplex mostraram uma sensibilidade limitada, embora também tenham encontrado patógenos clinicamente relevantes que não foram detectados com hemoculturas. Outra limitação é que multiplex-PCR detecta apenas no máximo 95% de todos os patógenos causadores de sepse. Em um estudo publicado recentemente, o autor concluiu que uma PCR multiplex testada "em amostras de sangue total" em conjunto com os métodos atuais baseados em cultura forneceu um valor clínico adicional. O futuro papel da PCR e de outras técnicas moleculares no cenário clínico precisa de uma avaliação mais aprofundada.

Um novo método que pode melhorar o diagnóstico de sepse e também ter a possibilidade de acompanhar a carga de DNA bacteriano durante o tratamento com antibióticos é o Droplet Digital PCR (ddPCR). Essa técnica permite uma quantificação absoluta do patógeno causador da sepse visando um gene específico da espécie ou o gene 16S ribossomal DNA (rDNA), presente em várias cópias por bactéria. No ddPCR, a amostra é dividida em cerca de 20.000 gotículas de água em óleo, e em todas elas ocorre a reação de PCR. Após a PCR, cada gota é analisada para determinar a fração de gotas positivas para PCR que fornece a quantidade de DNA bacteriano na amostra original. A concentração absoluta do molde de DNA alvo pode então ser calculada, uma vez que o tamanho das gotas é conhecido, e usando estatísticas de distribuição de Poisson para a correção de mais de uma reação positiva na mesma gota.

Para identificar o patógeno causador da sepse, pode ser usado o sequenciamento do gene 16S rDNA ou uma abordagem de metagenômica shotgun. Neste último, todo o DNA em uma amostra é sequenciado usando Next Generation Sequencing (NGS) e o patógeno causador da sepse pode ser detectado e visa ser quantificado por meio de análise de dados de bioinformática.

Durante o curso séptico, o paciente passa de vasodilatação para vazamento vascular e, finalmente, hipotensão. Isso, juntamente com o tratamento com fluido intravenoso adicionado, aumentará o volume de distribuição com um estado farmacocinético alterado para antibióticos adicionados. Além disso, a diminuição da função renal é comum em pacientes de UTI e o aumento da depuração de creatinina durante a fase aguda da sepse é descrito com frequência crescente. Portanto, é difícil prever a dose ideal de antibiótico para o paciente séptico. De fato, está demonstrado que em uma parcela considerável de pacientes internados em UTI não é alcançada uma exposição adequada aos antibióticos e isso está associado a um desfecho clínico negativo.

Uma resposta desregulada do hospedeiro é a pedra angular da compreensão atual da fisiopatologia da sepse. Inicialmente, durante o curso da sepse, uma resposta pró-inflamatória é induzida por genes de ativação precoce, incluindo citocinas associadas à inflamação: fator de necrose tumoral (TNF), Interleucina-1 (IL-1), IL-12 e IL-18. Simultaneamente, uma supressão imunológica é induzida por citocinas anti-inflamatórias, ou seja, IL-10 e fator de crescimento transformador. Sugere-se que uma homeostase interrompida da resposta pró e anti-inflamatória seja parte da resposta desregulada do hospedeiro na sepse, embora faltem biomarcadores disponíveis clinicamente para sua identificação. Além disso, os mediadores regulatórios envolvidos nesse processo e a associação com a depuração bacteriana durante a sepse precisam ser mais investigados.

O trato gastrointestinal pode ser uma fonte de bactérias e agravamento da inflamação séptica em pacientes internados em UTI, se a barreira epitelial for rompida. Assim, a função gastrointestinal intacta é crítica em pacientes com doenças graves. Não há biomarcadores clinicamente disponíveis da função gastrointestinal; no entanto, foi demonstrado que o escore de lesão gastrointestinal aguda (AGI) recentemente descrito se correlaciona com resultados adversos em pacientes de UTI.

O objetivo do estudo é investigar se o DNA bacteriano no sangue total medido com ddPCR pode ser usado para avaliação da depuração bacteriana em pacientes sépticos em terapia intensiva. Para isso, os investigadores procurarão uma possível associação entre a depuração do DNA bacteriano e a depuração da bacteremia detectada por hemoculturas.

Além disso, o objetivo é examinar uma possível relação entre a depuração do DNA bacteriano, os biomarcadores da resposta desregulada do hospedeiro e o resultado clínico no paciente séptico. O desfecho é medido como: mortalidade na UTI, mortalidade <28 dias, dias na UTI, alteração no escore Sequential Organ Failure Assessment (SOFA), tempo em ventilação assistida, depuração do lactato, necessidade de vasopressores e gravidade da lesão gastrointestinal. Além disso, o objetivo é estudar a relação entre a concentração de antibióticos beta-lactâmicos, ou seja, a concentração inibitória mínima para a bactéria (T>MIC) detectada e a depuração do DNA bacteriano. O material coletado também contribuirá para revelar a relação entre ddPCR e sequenciamento shot gun na detecção da bactéria causadora de sepse.