敗血症における細菌 DNA の定量化

血流感染によって引き起こされる敗血症症候群は、世界中の主要な医療問題であり、心臓以外の集中治療室 (ICU) における主要な死亡原因です。 敗血症に関する継続的な研究努力にもかかわらず、死亡率は 12 ～ 30% と高いままです。

重度の敗血症では、適切な抗生物質治療までの時間が生存に明らかに関連しています。 しかし、緊急治療室では、臨床症状の背後にある原因を特定し、抗生物質治療から最も恩恵を受ける患者を特定することは困難です. 抗生物質の無差別な使用は、必然的に細菌耐性と容認できない有害事象につながります。 したがって、誰が抗生物質を必要とし、誰が抗生物質の恩恵を受けないかを臨床医に知らせることができる新しい診断機器を開発するという、満たされていない大きな医学的必要性があります. さらに、原因となる微生物と患者の炎症状態を早期に特定することは、治療に関する決定を改善し、抗生物質の投与を減らすでしょう。

今日、血流感染症 (BSI) の診断のゴールド スタンダードは、血液培養とそれに続く標準的な検査手順による種および耐性パターンの同定です。 この手順は、高い特異性と関連していますが、感度も低いです。 臨床的に強い疑いがあるにもかかわらず、血液培養が陰性である理由として考えられるのは、培養ボトル内の血液量が不十分であるか、採血前に抗生物質で処理され、その後ボトル内で細菌が増殖できなくなったことです。

近年、細菌リボソーム RNA の特定のサブユニット (16S および 18S) の増幅に基づいて細菌 DNA を決定する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) が提案されています。 PCR は非常に少量の DNA を必要とします。 別の利点は、マルチプレックス PCR によって生存不能な細菌から細菌種を決定する可能性です。 ただし、これらのマルチプレックス PCR のほとんどは、血液培養では検出されなかった臨床関連病原体も発見したにもかかわらず、感度が限られていることが示されています。 もう 1 つの制限は、マルチプレックス PCR のみが病原体を引き起こすすべての敗血症の最大 95% を検出することです。 最近発表された研究で、著者は、現在の培養ベースの方法に加えて「全血検体で」テストされたマルチプレックス PCR が臨床的な付加価値を提供すると結論付けました。 臨床現場における PCR やその他の分子技術の将来の役割については、さらなる評価が必要です。

敗血症の診断を改善し、抗生物質治療中に細菌の DNA 負荷を追跡する可能性もある新しい方法は、ドロップレット デジタル PCR (ddPCR) です。 この技術は、細菌ごとにいくつかのコピーで存在する、種特異的遺伝子または 16S リボソーム DNA (rDNA) 遺伝子のいずれかを標的とする病原体を引き起こす敗血症の絶対定量化を可能にします。 ddPCR では、サンプルは約 20,000 個の油中水滴に分割され、そのすべてで PCR 反応が発生します。 PCRに続いて、各液滴を分析して、元のサンプル中の細菌DNAの量を与えるPCR陽性液滴の割合を決定します。 次に、液滴のサイズが既知であるため、同じ液滴内の複数の陽性反応の補正にポアソン分布統計を使用することにより、標的 DNA テンプレートの絶対濃度を計算できます。

敗血症の原因となる病原体を特定するには、16S rDNA 遺伝子の配列決定またはショットガン メタゲノミクス アプローチを使用できます。 後者では、サンプル中のすべての DNA が次世代シーケンシング (NGS) を使用して配列決定され、敗血症の原因となる病原体を検出し、バイオインフォマティクス データ分析によって定量化することを目的としています。

敗血症の経過中、患者は血管拡張から血管漏出、そして最終的には低血圧に移行します。 これは、追加の静脈内輸液処理と合わせて、追加された抗生物質の薬物動態状態が変化し、分布量が増加します。 さらに、ICU患者では腎機能の低下が一般的であり、敗血症の急性期におけるクレアチニンクリアランスの増加が頻繁に報告されています。 したがって、敗血症患者に最適な抗生物質の投与量を予測することは困難です。 実際、ICU患者のかなりの部分で適切な抗生物質への曝露が達成されておらず、これは否定的な臨床結果に関連していることが示されています.

調節不全の宿主応答は、敗血症の病態生理学の現在の理解の基礎です。 敗血症の初期段階では、炎症に関連するサイトカイン（腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン-1（IL-1）、IL-12、IL-18）などの早期活性化遺伝子によって炎症誘発性反応が誘導されます。 同時に、抗炎症性サイトカイン、すなわちIL-10およびトランスフォーミング増殖因子によって免疫抑制が誘導されます。 炎症誘発性および抗炎症性応答の恒常性の乱れは、敗血症における調節不全の宿主応答の一部であることが示唆されていますが、その同定のための臨床的に利用可能なバイオマーカーは不足しています。 さらに、このプロセスに関与する調節メディエーターと、敗血症中の細菌クリアランスとの関連については、さらに調査する必要があります。

上皮バリアが破壊されると、消化管が細菌の発生源となり、ICU 患者の敗血症性炎症が悪化する可能性があります。 したがって、重篤な患者では消化管機能が損なわれていないことが重要です。 胃腸機能の臨床的に利用可能なバイオマーカーはありません。しかし、最近報告された急性胃腸障害 (AGI) スコアは、ICU 患者の有害転帰と相関することが示されています。

この研究の目的は、ddPCR で測定した全血中の細菌 DNA を、敗血症の集中治療患者の細菌クリアランスの評価に使用できるかどうかを調査することです。 そうするために、研究者は、細菌の DNA クリアランスと血液培養によって検出された菌血症のクリアランスとの間の潜在的な関連性を検索します。

さらに、細菌 DNA のクリアランス、調節不全の宿主応答のバイオマーカー、および敗血症患者の臨床転帰との間の可能な関係を調べることを目的としています。 結果は次のように測定されます: ICU での死亡率、28 日未満の死亡率、ICU での日数、逐次臓器不全評価スコア (SOFA) の変化、補助換気の時間、乳酸クリアランス、昇圧剤の必要性、および胃腸損傷の重症度。 さらに、目的は、β-ラクタム系抗生物質の濃度、つまり検出された細菌の最小発育阻止濃度 (T>MIC) と細菌 DNA のクリアランスとの関係を研究することです。 収集された資料は、敗血症を引き起こす細菌の検出における ddPCR とショットガン シーケンスの関係を明らかにするのにも役立ちます。