Kwantificering van bacterieel DNA bij sepsis

Septisch syndroom veroorzaakt door bloedbaaninfecties vormt wereldwijd een groot probleem in de gezondheidszorg en is de belangrijkste doodsoorzaak op de niet-cardiale intensive care (ICU). Ondanks voortdurende onderzoeksinspanningen op het gebied van sepsis, blijft de mortaliteit oplopen tot 12-30%.

Bij ernstige sepsis is de tijd tot adequate antibiotische therapie duidelijk gekoppeld aan overleving. Op de spoedeisende hulp is het echter een uitdaging om de oorzaak achter de klinische presentatie te achterhalen en patiënten te identificeren die het meeste baat zouden hebben bij een behandeling met antibiotica. Een willekeurig gebruik van antibiotica leidt onvermijdelijk tot bacteriële resistentie en onaanvaardbare bijwerkingen. Er is dus een grote en onvervulde medische behoefte om nieuwe diagnostische instrumenten te ontwikkelen die de clinicus kunnen informeren over wie antibiotica nodig heeft en wie er geen baat bij heeft. Bovendien zou een vroege identificatie van het oorzakelijke micro-organisme en de ontstekingsstatus van de patiënten de beslissingen over behandelingen verbeteren en de toediening van antibiotica verminderen.

Tegenwoordig is de gouden standaard voor de diagnose van bloedbaaninfecties (BSI) bloedkweek gevolgd door identificatie van soort en resistentiepatroon door standaard laboratoriumprocedures. Deze procedure wordt geassocieerd met een hoge specificiteit maar ook met een lage sensitiviteit. Mogelijke redenen voor een negatieve bloedkweek, ondanks een sterk klinisch vermoeden, kunnen onvoldoende bloedvolume in de kweekflessen zijn of antibiotische behandeling voorafgaand aan bloedafname met als gevolg dat de bacteriën niet in de flessen groeien.

In de afgelopen jaren is de polymerasekettingreactie (PCR) voorgesteld als een methode om bacterieel DNA te bepalen op basis van amplificatie van specifieke subeenheden (16S en 18S) van bacterieel ribosomaal RNA. PCR vereist een zeer kleine hoeveelheid DNA. Een ander voordeel is de mogelijkheid om bacteriesoorten te bepalen van niet-levensvatbare bacteriën door middel van multiplex PCR's. De meeste van die multiplex-PCR's hebben echter een beperkte gevoeligheid getoond, hoewel ze ook klinisch relevante pathogenen vonden die niet werden gedetecteerd met bloedkweken. Een andere beperking is dat multiplex-PCR slechts maximaal 95% van alle sepsis veroorzakende ziekteverwekkers detecteert. In een recent gepubliceerde studie concludeerde de auteur dat een geteste multiplex PCR "op volbloedmonsters" in aanvulling op de huidige op cultuur gebaseerde methoden een klinische toegevoegde waarde opleverde. De toekomstige rol van PCR en andere moleculaire technieken in de klinische setting moet verder worden geëvalueerd.

Een nieuwe methode die de diagnostiek van sepsis zou kunnen verbeteren en tevens de mogelijkheid heeft om de bacteriële DNA belasting te volgen tijdens antibioticabehandeling is Droplet Digital PCR (ddPCR). Deze techniek maakt een absolute kwantificering mogelijk van de sepsis-veroorzakende ziekteverwekker gericht op ofwel een soortspecifiek gen of het 16S ribosomaal DNA (rDNA)-gen, aanwezig in meerdere kopieën per bacterie. Bij ddPCR wordt het monster verdeeld in ongeveer 20.000 water-in-olie-druppeltjes, en in al deze druppeltjes vindt de PCR-reactie plaats. Na PCR wordt elke druppel geanalyseerd om de fractie PCR-positieve druppeltjes te bepalen die de hoeveelheid bacterieel DNA in het oorspronkelijke monster geeft. De absolute doel-DNA-matrijsconcentratie kan vervolgens worden berekend, aangezien de grootte van de druppeltjes bekend is, en door Poisson-verdelingsstatistieken te gebruiken voor de correctie van meer dan één positieve reactie in dezelfde druppel.

Om de sepsis te identificeren die de ziekteverwekker veroorzaakt, kan sequencing van het 16S rDNA-gen of een shotgun-metagenomics-benadering worden gebruikt. In het laatste geval wordt al het DNA in een monster gesequenced met behulp van Next Generation Sequencing (NGS) en kan de sepsis-veroorzakende ziekteverwekker zowel worden gedetecteerd als worden gekwantificeerd door middel van bioinformatica-gegevensanalyse.

Tijdens het septische beloop gaat de patiënt van vasodilatatie naar vasculaire lekkage en tenslotte hypotensie. Dit samen met toegevoegde intraveneuze vloeistofbehandeling zal het distributievolume verhogen met een gewijzigde farmacokinetische toestand voor toegevoegde antibiotica. Verder komt een verminderde nierfunctie veel voor bij IC-patiënten en wordt een verhoogde creatinineklaring tijdens de acute fase van sepsis steeds vaker beschreven. Daarom is het moeilijk om de optimale antibioticadosis voor de septische patiënt te anticiperen. Het is inderdaad aangetoond dat bij een aanzienlijk deel van de IC-patiënten een adequate blootstelling aan antibiotica niet wordt bereikt en dit wordt geassocieerd met een negatief klinisch resultaat.

Een ontregelde gastheerrespons is een hoeksteen van het huidige begrip van de pathofysiologie van sepsis. Aanvankelijk wordt tijdens het sepsisverloop een pro-inflammatoire respons geïnduceerd door vroege activeringsgenen, waaronder cytokines die geassocieerd zijn met ontsteking: tumornecrosefactor (TNF), interleukine-1 (IL-1), IL-12 en IL-18. Tegelijkertijd wordt een immuunsuppressie geïnduceerd door ontstekingsremmende cytokines, d.w.z. IL-10 en transformerende groeifactor. Er wordt gesuggereerd dat een verstoorde homeostase van de pro- en ontstekingsremmende respons deel uitmaakt van de ontregelde gastheerrespons bij sepsis, hoewel klinisch beschikbare biomarkers voor de identificatie ervan ontbreken. Bovendien moeten de regulerende bemiddelaars die bij dit proces betrokken zijn en de associatie met bacteriële klaring tijdens sepsis nader worden onderzocht.

Het maagdarmkanaal kan een bron van bacteriën zijn en een verergering van de septische ontsteking bij IC-patiënten, als de epitheelbarrière verstoord is. Een intacte gastro-intestinale functie is dus van cruciaal belang bij ernstig zieke patiënten. Er zijn geen klinisch beschikbare biomarkers van gastro-intestinale functie; er is echter aangetoond dat de recent beschreven acute gastro-intestinale letselscore (AGI) correleert met een nadelige uitkomst bij IC-patiënten.

Het doel van de studie is om te onderzoeken of bacterieel DNA in volbloed gemeten met ddPCR kan worden gebruikt voor het beoordelen van bacteriële klaring bij septische intensive care-patiënten. Om dit te doen, zullen de onderzoekers zoeken naar een mogelijk verband tussen de klaring van bacterieel DNA en de klaring van bacteriëmie gedetecteerd door bloedkweken.

Verder is het doel om een ​​mogelijke relatie tussen klaring van bacterieel DNA, biomarkers van ontregelde gastheerrespons en klinische uitkomst bij de septische patiënt te onderzoeken. Het resultaat wordt gemeten als: mortaliteit op de IC, mortaliteit <28 dagen, dagen op de ICU, verandering in Sequential Organ Failure Assessment Score (SOFA), tijd in geassisteerde beademing, lactaatklaring, behoefte aan vasopressoren en ernst van gastro-intestinaal letsel. Verder is het doel om de relatie te bestuderen tussen de concentratie van bèta-lactam-antibiotica, d.w.z. de minimale remmende concentratie voor de gedetecteerde bacteriën (T>MIC) en de klaring van bacterieel DNA. Het verzamelde materiaal zal ook bijdragen aan het onthullen van de relatie tussen ddPCR en shot gun-sequencing bij het detecteren van de sepsis-veroorzakende bacteriën.