Cuantificación de ADN bacteriano en sepsis

El síndrome séptico causado por infecciones del torrente sanguíneo representa un importante problema de salud en todo el mundo y es la principal causa de mortalidad en la unidad de cuidados intensivos (UCI) no cardiaca. A pesar de los esfuerzos de investigación en curso en la sepsis, la mortalidad sigue siendo tan alta como 12-30%.

En la sepsis grave, el tiempo hasta la terapia antibiótica adecuada se ha relacionado claramente con la supervivencia. Sin embargo, en la sala de emergencias, es un desafío identificar la causa detrás de la presentación clínica e identificar a los pacientes que se beneficiarían más del tratamiento con antibióticos. Un uso indiscriminado de antibióticos conduce inevitablemente a la resistencia bacteriana y eventos adversos inaceptables. Por lo tanto, existe una gran necesidad médica no satisfecha de desarrollar nuevos instrumentos de diagnóstico que puedan informar al médico sobre quién necesitaría antibióticos y quién no se beneficiaría de ellos. Además, la identificación precoz del microorganismo causal y el estado inflamatorio de los pacientes mejoraría las decisiones de tratamiento y reduciría la administración de antibióticos.

Hoy en día, el estándar de oro para el diagnóstico de infecciones del torrente sanguíneo (BSI) es el hemocultivo seguido de la identificación de especies y patrones de resistencia mediante procedimientos estándar de laboratorio. Este procedimiento se asocia con una alta especificidad pero también con una baja sensibilidad. Las razones probables de un hemocultivo negativo a pesar de una fuerte sospecha clínica podrían ser un volumen de sangre insuficiente en los frascos de cultivo o el tratamiento con antibióticos antes de la toma de muestras de sangre con la consiguiente falla de crecimiento de bacterias en los frascos.

En los últimos años se ha propuesto la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como método para determinar el ADN bacteriano basado en la amplificación de subunidades específicas (16S y 18S) del ARN ribosomal bacteriano. La PCR requiere una cantidad muy pequeña de ADN. Otra ventaja es la posibilidad de determinar especies bacterianas a partir de bacterias no viables mediante PCR multiplex. Sin embargo, la mayoría de esas PCR multiplex han mostrado una sensibilidad limitada a pesar de que también encontraron patógenos clínicamente relevantes que no se detectaron con hemocultivos. Otra limitación es que multiplex-PCR solo detecta como máximo el 95% de todos los patógenos que causan sepsis. En un estudio publicado recientemente, el autor concluyó que una PCR multiplex probada "en especímenes de sangre completa" junto con los métodos actuales basados ​​en cultivos proporcionó un valor clínico adicional. El papel futuro de la PCR y otras técnicas moleculares en el entorno clínico necesita una evaluación adicional.

Un nuevo método que podría mejorar el diagnóstico de la sepsis y también tener la posibilidad de seguir la carga de ADN bacteriano durante el tratamiento con antibióticos es Droplet Digital PCR (ddPCR). Esta técnica permite una cuantificación absoluta del patógeno que causa la sepsis y se dirige a un gen específico de la especie o al gen del ADN ribosómico 16S (ADNr), presente en varias copias por bacteria. En ddPCR, la muestra se divide en unas 20.000 gotas de agua en aceite, y en todas ellas se produce la reacción de PCR. Después de la PCR, cada gota se analiza para determinar la fracción de gotas PCR positivas que dan la cantidad de ADN bacteriano en la muestra original. A continuación, se puede calcular la concentración de plantilla de ADN diana absoluta, ya que se conoce el tamaño de las gotitas, y mediante el uso de estadísticas de distribución de Poisson para la corrección de más de una reacción positiva en la misma gotita.

Para identificar el patógeno que causa la sepsis, podría usarse la secuenciación del gen 16S rDNA o un enfoque metagenómico de escopeta. En este último, todo el ADN de una muestra se secuencia utilizando secuenciación de próxima generación (NGS) y el patógeno que causa la sepsis puede detectarse y pretende cuantificarse a través del análisis de datos bioinformáticos.

Durante el curso séptico el paciente pasa de la vasodilatación a la fuga vascular y finalmente a la hipotensión. Esto, junto con el tratamiento con fluidos intravenosos agregados, aumentará el volumen de distribución con un estado farmacocinético alterado para los antibióticos agregados. Además, la disminución de la función renal es común en los pacientes de la UCI y se describe con mayor frecuencia el aumento del aclaramiento de creatinina durante la fase aguda de la sepsis. Por lo tanto, es difícil anticipar la dosis óptima de antibiótico para el paciente séptico. De hecho, se muestra que en una parte considerable de los pacientes de la UCI no se logra una exposición adecuada a los antibióticos y esto se asocia con un resultado clínico negativo.

Una respuesta del huésped desregulada es la piedra angular de la comprensión actual de la fisiopatología de la sepsis. Inicialmente, durante el curso de la sepsis, los genes de activación temprana inducen una respuesta proinflamatoria, incluidas las citocinas asociadas con la inflamación: factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina-1 (IL-1), IL-12 e IL-18. Simultáneamente, las citocinas antiinflamatorias, es decir, la IL-10 y el factor de crecimiento transformante, inducen una inmunosupresión. Se sugiere que una homeostasis interrumpida de la respuesta proinflamatoria y antiinflamatoria es parte de la respuesta desregulada del huésped en la sepsis, aunque faltan biomarcadores clínicamente disponibles para su identificación. Además, los mediadores reguladores involucrados en este proceso y la asociación con la eliminación bacteriana durante la sepsis necesitan más investigación.

El tracto gastrointestinal puede ser una fuente de bacterias y un empeoramiento de la inflamación séptica en pacientes de la UCI, si se rompe la barrera epitelial. Por lo tanto, la función gastrointestinal intacta es crítica en pacientes gravemente enfermos. No existen biomarcadores clínicamente disponibles de la función gastrointestinal; sin embargo, se ha demostrado que la puntuación de lesión gastrointestinal aguda (AGI) descrita recientemente se correlaciona con resultados adversos en pacientes de la UCI.

El objetivo del estudio es investigar si el ADN bacteriano en sangre total medido con ddPCR se puede utilizar para evaluar la eliminación bacteriana en pacientes sépticos en cuidados intensivos. Para ello, los investigadores buscarán una posible asociación entre la eliminación del ADN bacteriano y la eliminación de la bacteriemia detectada por hemocultivos.

Además, el objetivo es examinar una posible relación entre la eliminación del ADN bacteriano, los biomarcadores de la respuesta desregulada del huésped y el resultado clínico en el paciente séptico. El resultado se mide como: mortalidad en la UCI, mortalidad <28 días, días en la UCI, cambio en la puntuación de evaluación secuencial de insuficiencia orgánica (SOFA), tiempo en ventilación asistida, eliminación de lactato, necesidad de vasopresores y gravedad de la lesión gastrointestinal. Además, el objetivo es estudiar la relación entre la concentración de antibióticos betalactámicos, es decir, la concentración inhibitoria mínima para la bacteria (T>MIC) detectada y la eliminación del ADN bacteriano. El material recolectado también contribuirá a revelar la relación entre la ddPCR y la secuenciación de pistola en la detección de las bacterias que causan la sepsis.