Quantificazione del DNA batterico nella sepsi

La sindrome settica causata da infezioni del flusso sanguigno rappresenta un grave problema sanitario in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità nelle unità di terapia intensiva non cardiaca (ICU). Nonostante gli sforzi di ricerca in corso sulla sepsi, la mortalità rimane al 12-30%.

Nella sepsi grave, il tempo per un'adeguata terapia antibiotica è stato chiaramente collegato alla sopravvivenza. Tuttavia, al pronto soccorso, è difficile identificare la causa alla base della presentazione clinica e identificare i pazienti che trarrebbero i maggiori benefici dal trattamento antibiotico. Un uso indiscriminato di antibiotici porta inevitabilmente a resistenze batteriche ed eventi avversi inaccettabili. Pertanto, esiste una grande e insoddisfatta esigenza medica di sviluppare nuovi strumenti diagnostici che potrebbero informare il medico su chi avrebbe bisogno di antibiotici e chi non ne trarrebbe beneficio. Inoltre, l'identificazione precoce del microrganismo causale e dello stato infiammatorio dei pazienti migliorerebbe le decisioni sui trattamenti e ridurrebbe la somministrazione di antibiotici.

Oggi il gold standard per la diagnosi delle infezioni del flusso sanguigno (BSI) è l'emocoltura seguita dall'identificazione delle specie e del modello di resistenza mediante procedure di laboratorio standard. Questa procedura è associata a un'elevata specificità ma anche a una bassa sensibilità. Le probabili ragioni per un'emocoltura negativa nonostante un forte sospetto clinico potrebbero essere un volume di sangue insufficiente nei flaconi di coltura o un trattamento antibiotico prima del prelievo di sangue con conseguente mancata crescita dei batteri nei flaconi.

Negli ultimi anni la reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata proposta come metodo per determinare il DNA batterico basato sull'amplificazione di subunità specifiche (16S e 18S) dell'RNA ribosomiale batterico. La PCR richiede una quantità molto piccola di DNA. Un altro vantaggio è la possibilità di determinare specie batteriche da batteri non vitali mediante PCR multiplex. Tuttavia, la maggior parte di queste PCR multiplex ha mostrato una sensibilità limitata, anche se hanno trovato anche agenti patogeni clinicamente rilevanti che non sono stati rilevati con le emocolture. Un'altra limitazione è che la multiplex-PCR rileva solo al massimo il 95% di tutti i patogeni che causano la sepsi. In un recente studio pubblicato, l'autore ha concluso che una PCR multiplex testata "su campioni di sangue intero" in aggiunta agli attuali metodi basati sulla coltura ha fornito un valore aggiunto clinico. Il ruolo futuro della PCR e di altre tecniche molecolari in ambito clinico necessita di un'ulteriore valutazione.

Un nuovo metodo che potrebbe migliorare la diagnostica della sepsi e avere anche la possibilità di seguire la carica del DNA batterico durante il trattamento antibiotico è il Droplet Digital PCR (ddPCR). Questa tecnica consente una quantificazione assoluta del patogeno che causa la sepsi che prende di mira un gene specifico della specie o il gene del DNA ribosomiale 16S (rDNA), presente in diverse copie per batteri. Nella ddPCR, il campione viene suddiviso in circa 20.000 goccioline acqua-in-olio, e in tutte si verifica la reazione PCR. Dopo la PCR, ogni gocciolina viene analizzata per determinare la frazione di goccioline positive alla PCR che fornisce la quantità di DNA batterico nel campione originale. È quindi possibile calcolare la concentrazione assoluta del modello di DNA target, poiché la dimensione delle goccioline è nota e utilizzando le statistiche di distribuzione di Poisson per la correzione di più di una reazione positiva nella stessa gocciolina.

Per identificare la sepsi che causa il sequenziamento del patogeno del gene 16S rDNA o un approccio di metagenomica shotgun potrebbe essere utilizzato. In quest'ultimo, tutto il DNA in un campione viene sequenziato utilizzando Next Generation Sequencing (NGS) e l'agente patogeno che causa la sepsi può essere sia rilevato sia mirato a essere quantificato attraverso l'analisi dei dati bioinformatici.

Durante il decorso settico il paziente passa dalla vasodilatazione alla perdita vascolare e infine all'ipotensione. Questo insieme all'aggiunta di un trattamento con fluidi per via endovenosa aumenterà il volume di distribuzione con uno stato farmacocinetico alterato per gli antibiotici aggiunti. Inoltre, la ridotta funzionalità renale è comune nei pazienti in terapia intensiva e l'aumento della clearance della creatinina durante la fase acuta della sepsi è descritto con frequenza crescente. Pertanto, è difficile prevedere la dose ottimale di antibiotico per il paziente settico. Infatti, è dimostrato che in una parte considerevole dei pazienti in terapia intensiva non si ottiene un'adeguata esposizione agli antibiotici e ciò è associato a un esito clinico negativo.

Una risposta dell'ospite disregolata è una pietra angolare dell'attuale comprensione della fisiopatologia della sepsi. Inizialmente, durante il decorso della sepsi, una risposta proinfiammatoria è indotta da geni di attivazione precoce, comprese le citochine associate all'infiammazione: fattore di necrosi tumorale (TNF), interleuchina-1 (IL-1), IL-12 e IL-18. Simultaneamente una soppressione immunitaria è indotta da citochine antinfiammatorie come IL-10 e fattore di crescita trasformante. Si suggerisce che un'omeostasi interrotta della risposta pro e antinfiammatoria faccia parte della risposta dell'ospite disregolata nella sepsi, sebbene manchino biomarcatori clinicamente disponibili per la sua identificazione. Inoltre, i mediatori normativi coinvolti in questo processo e l'associazione alla clearance batterica durante la sepsi necessitano di ulteriori indagini.

Il tratto gastrointestinale può essere una fonte di batteri e un peggioramento dell'infiammazione settica nei pazienti in terapia intensiva, se la barriera epiteliale viene interrotta. Pertanto, la funzione gastrointestinale intatta è fondamentale nei pazienti gravemente malati. Non ci sono biomarcatori clinicamente disponibili della funzione gastrointestinale; tuttavia, è stato dimostrato che il punteggio di lesione gastrointestinale acuta (AGI) recentemente descritto è correlato con l'esito avverso nei pazienti in terapia intensiva.

Lo scopo dello studio è indagare se il DNA batterico nel sangue intero misurato con ddPCR possa essere utilizzato per la valutazione della clearance batterica nei pazienti settici in terapia intensiva. Per fare ciò gli investigatori cercheranno una potenziale associazione tra la clearance del DNA batterico e la clearance della batteriemia rilevata dalle emocolture.

Inoltre, l'obiettivo è quello di esaminare una possibile relazione tra la clearance del DNA batterico, i biomarcatori della risposta dell'ospite disregolata e l'esito clinico nel paziente settico. L'esito è misurato come: mortalità in terapia intensiva, mortalità <28 giorni, giorni in terapia intensiva, variazione del punteggio SOFA (Sequential Organ Failure Assessment score), tempo in ventilazione assistita, clearance del lattato, necessità di vasopressori e gravità del danno gastrointestinale. Inoltre, l'obiettivo è quello di studiare la relazione tra la concentrazione di antibiotici beta-lattamici, ovvero la concentrazione minima inibente per i batteri (T>MIC) rilevata e la clearance del DNA batterico. Il materiale raccolto contribuirà anche a rivelare la relazione tra ddPCR e shot gun sequencing nel rilevare i batteri che causano la sepsi.