Terapie toxické optické neuropatie kombinací kmenových buněk s elektromagnetickou stimulací (Magnovision)

Tato prospektivní, otevřená klinická studie fáze 3 byla provedena na lékařské fakultě Ankarské univerzity, klinice oftalmologie v období od dubna 2019 do dubna 2021. Do studie bylo zahrnuto 36 očí 18 pacientů s toxickou neuropatií zrakového nervu. Primární diagnóza toxické neuropatie zrakového nervu (TON) byla stanovena na klinikách akutní péče nebo intenzivní péče. Do studie byli zařazeni pacienti, kteří byli přijati do 3 měsíců po první intervenci. Všichni zařazení pacienti podstoupili kompletní rutinní oftalmologické vyšetření, včetně měření nejlépe korigované zrakové ostrosti (BCVA) s grafem studie časné léčby diabetické retinopatie (ETDRS) (Topcon CC 100 XP, Japonsko). Pacienti byli dále hodnoceni pomocí optické koherentní tomografické angiografie (OCTA) od RTVue XR (Avanti, Optovue, Fremont, CA, USA), aby bylo možné analyzovat a změřit změny ve vrstvě komplexu gangliových buněk (GCC), která poskytla typický spoluregistrovaný en -platforma pro multimodální zobrazování obličeje a průřezu. Funkční hodnocení zrakového nervu bylo následováno testem zorného pole Compass 24/2 (VF) (Compass, CenterVue, Padova, Itálie) a 120' vzorovým testem vizuálního evokovaného potenciálu (pVEP) (Po 2018F, Metrovision, Perenchies, Francie).

Subjekty Do studie bylo zahrnuto 36 očí 18 pacientů s TON.

Kritéria zařazení se skládala z několika parametrů:

• Případy otravy toxickým činidlem do 3 měsíců
• Pacienti s BCVA lepší než 35 písmen
• Jakýkoli stupeň ztráty zorného pole
• Pacienti starší 18 let

Kritéria vyloučení se skládala z několika parametrů:

• Případy otrávené toxickým činidlem déle než 3 měsíce
• Pacienti s BCVA méně než 35 písmen: správně provést test zorného pole
• Neurologické následky, které nelze spolupracovat
• Kouření

U všech pacientů s intoxikací metanolem byl před přijetím na naši kliniku aplikován stejný léčebný protokol. Všem pacientům byla podána hemodialýza, bikarbonát a etanol. Případy byly rozděleny do 3 skupin podle podobných demografických charakteristik.

Skupina 1: Skládá se z 12 očí 12 pacientů léčených kombinací WJ-MSC a rEMS na jednom oku. WJ-MSC byl aplikován pouze jednou před aplikacemi rEMS. Aplikace rEMS byla zahájena 10 dní po aplikaci WJ-MSC. Aplikace rEMS byla aplikována s na míru navrženou helmou po dobu 30 minut po aplikaci WJ-MSC. Aplikace rEMS byly opakovány 10krát s 1 týdenním intervalem. Průběh byl hodnocen porovnáním BCVA, FPDI, tloušťky GCC, latence pVEP-p100 a parametrů amplitudy před a 3. měsícem aplikace.

Skupina 2: Skládá se z 12 očí 12 pacientů léčených pouze rEMS na jednom oku. rEMS byl aplikován s na míru navrženou helmou po dobu 30 minut. Aplikace rEMS byly opakovány 10krát s 1 týdenním intervalem. Průběh byl hodnocen porovnáním BCVA, FPDI, tloušťky GCC, latence pVEP-p100 a parametrů amplitudy před a 3. měsícem aplikace.

Skupina 3: Skládá se z 12 očí 6 pacientů léčených pouze WJ-MSC ve dvou očích. WJ-MSC byl aplikován pouze jednou na obě oči. Průběh byl hodnocen porovnáním BCVA, FPDI, tloušťky GCC, latence pVEP-p100 a parametrů amplitudy před a 3. měsícem aplikace.

Příprava mezenchymálních kmenových buněk pocházejících z Whartonova rosolu Mezenchymální kmenové buňky použité v této studii byly izolovány z Whartonova rosolu pupeční šňůry, který byl odebrán alogenně od jediného dárce se souhlasem matky. Vzorek pupeční šňůry byl ošetřen v několika krocích. Stručně, tkáň pupečníku byla dvakrát promyta fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (Lonza, Švýcarsko) a část Whartonova želé byla rozemleta pomocí kleští a skalpelu. Nasekané kousky byly kultivovány v misce pro buněčnou kulturu (Greiner Bio-One, Německo) s Dulbeccem modifikovaným Eagleovým médiem F12 (DMEM) s nízkým obsahem glukózy bez L-glutaminu (Bilogical Industries, Izrael) a 10% lidským AB sérem (Capricorn, Německo ), 1 % 10 000 U/ml penicilinu a 10 000 ug/ml streptomycinu (Gibco, USA). Všechny buněčné přípravy a kultivační postupy byly prováděny v současné akreditované laboratoři Good Manufacturing Practice (cGMP) (Onkim Stem Cell Technologies, Turecko). Buňky expandované v kultuře byly kryokonzervovány v P3 za použití standardních kryokonzervačních protokolů až do použití v následujícím experimentu. Jako kryokonzervant byl použit CryoSure-DEX40 (WAK-Chemie Medical, Německo) obsahující 55 % dimethylsulfoxidu a 5 % dextranu 40. Buňky byly charakterizovány v době kryokonzervace pomocí průtokové cytometrické analýzy pro stanovení exprese pozitivního shluku diferenciačních (CD) povrchových markerů, CD90, CD105, CD73, CD44, CD29, a negativních pro CD34, CD45 a CD11b. Pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR) byly analyzovány exprese několika genů, jako je nádorová nekróza alfa (TNF alfa) a vimentin (VIM). Kromě toho byly také dokončeny analýzy kontroly kvality, jako je analýza mykoplazmat a endotoxinů (pomocí testu PCR a LAL v kombinaci s analýzou sterility). Buňky byly solubilizovány z kryokonzervace předtím, než byly připraveny pro injekci. Průměrná životaschopnost buněk pro každou léčbu byla přes 90,0 % a každý pacient dostal 2-6 x 106 buněk v 1,5 ml fyziologického roztoku.

Injekce WJ-MSC z pupečníku Suspenze WJ-MSCs z kultury byla dopravena na operační sál chladícím řetězcem a použita do 24 hodin. Celkem 1,5 ml suspenze WJ-MSC bylo okamžitě injikováno do subtenonového prostoru každého oka. Zákrok byl proveden v topické anestezii kapkami proparakain hydrochloridu (Alcaine, Alcon, USA) a sterilních podmínkách. Na limbus byl aplikován atraumatický trakční steh 5/0 pro snadný přístup a manipulaci do oblasti aplikace. Po operaci byly čtyřikrát denně podávány oční kapky loteprednol a tobramycin po dobu jednoho týdne a perorální amoxicilin klavulonát (1 g) byl podáván dvakrát denně po dobu pěti dnů

Retinální repetitivní elektromagnetická stimulace (rEMS) Přilba rEMS (MagnovisionTM, Bioretina Biotechnology, Ankara, Turecko) stimulovala sítnici a zrakové dráhy silou elektromagnetického pole 2000 miligauss, frekvencí 42 hertzů a trváním 30 minut. Tyto hodnoty byly dříve stanoveny jako účinné pro jiné klinické a preklinické studie.

Časové okno

Pacienti byli hodnoceni v několika časových bodech studie:

• T0 (základní hodnota): bezprostředně před aplikacemi
• T1: 1. měsíc aplikací
• T2: 3. měsíc aplikací

Primární měření výsledku • ETDRS zraková ostrost: Skóre zrakové ostrosti získané z vyšetření T0 a T2 bylo analyzováno a porovnáno pomocí statistických testů ke stanovení účinnosti.

Míry sekundárních výsledků

• Citlivost zorného pole: Index odchylky perimetrie fundu (FPDI, %) FPDI byl vyšetřen v 24/2 zorném poli počítačových perimetrických záznamů. FPDI nabízí data vysvětlující, kolik ze 100 blikajících bodů a jaké procento zorného pole může pacient správně vidět. Pro analýzu VF, aby se předešlo chybám během testu, byla před aplikací třikrát provedena cvičná kola.

• Tloušťka komplexu gangliových buněk (tloušťka GCC, µm): GCC je tloušťka od vnitřní omezující membrány k vnitřní plexiformní vrstvě v oblasti fovey 3x3 mm. Měření se provádí automaticky přístrojem OCTA. GCC je celková tloušťka gangliových buněk a nervových vláken sítnice.

• Pattern visual evoked potential (pVEP) pVEP je objektivní test, který měří elektrickou aktivitu optické dráhy v reakci na světelný podnět. Vzory 120' odhalují odpovědi ze všech kvadrantů sítnice. Měření byla provedena podle standardů ISCEV pro obě oči. K vytvoření numerického výsledku jsme použili 120'pattern VEP protokol, který kombinuje p100 implicitní čas a amplitudu.