Vývoj neinvazivní prenatální diagnostiky jednogenových poruch (DANNIgene)

Od identifikace cffDNA v mateřské plazmě v roce 1997 došlo k rychlému vývoji ve využívání její přítomnosti pro prenatální diagnostiku a screening. První důkazy o principiálních studiích využívajících cfDNA z mateřské plazmy k detekci fetální aneuploidie byly publikovány v roce 2008, poté došlo k rychlé komercializaci. V současné době je neinvazivní prenatální testování (NIPT) na aneuploidií široce používáno po celém světě jako screeningový test na nejčastější trizomie plodu. Na rozdíl od neinvazivního prenatálního testování, kde pozitivní výsledek vyžaduje potvrzení po invazivním testu, nabízí neinvazivní prenatální diagnostika (NIPD) výhodu definitivní diagnózy bez invazivního postupu – a s tím spojeného rizika potratu – protože omezený placentární mozaikismus nezpůsobuje se vyskytují u NIPD pro poruchy jednoho genu (SGD).

NIPD lze v těhotenství nabídnout dříve než invazivní testování, od 7. týdne těhotenství. To může snížit úzkost rodičů a poskytuje více času na rozhodování a plánování. Pro SGD-NIPD skutečně existují značné problémy, které je třeba překonat. i/ Cirkulující cffDNA, která se uvolňuje z placenty přibližně od 4. týdne gestace, tvoří pouze 5%-20% celkové cirkulující cfDNA v mateřské plazmě. Toto procento se zvyšuje s těhotenstvím a je ovlivněno faktory, jako je hmotnost matky, kouření a těhotenské komplikace, jako je preeklampsie. V důsledku toho jsou k detekci variant ve fetální DNA vyžadovány optimalizované techniky a vysoce citlivé detekční přístupy. ii/ fetální frakce musí být vypočtena, aby se potvrdilo, že jsou přítomny dostatečné hladiny cffDNA, a aby se zabránilo falešně negativním výsledkům. iii/ Dalším problémem je krátká délka fragmentu cffDNA, která ztěžuje detekci tripletových repetic a velkých delecí nebo duplikací.

Kromě určení pohlaví plodu a statusu Rhesus D u plodu byl tým hlavního výzkumníka prvním, kdo navrhl SGD-NIPD pro použití v klinické praxi ve Francii u autozomálních poruch způsobených de novo nebo otcovsky zděděnými mutacemi, u kterých lze snadno najít varianty ve fetální DNA. odlišuje se na vysokém pozadí mateřské cfDNA. K cílení jedné mutace pro tuto analýzu lze použít kapkovou digitální polymerázovou řetězovou reakci nebo sekvenování nové generace.

Tento přístup však vyžaduje vývoj specifický pro mutace a je omezen na bodové mutace, které v mateřské DNA chybí. NIPD pro X-vázané poruchy, stejně jako autozomálně dominantně mateřsky dědičné nebo autozomálně recesivní poruchy, u nichž jsou oba rodiče přenašeči stejné mutace, představuje větší výzvu. Ke zjištění fetální dědičnosti mateřské mutace je zapotřebí kvantitativní přístup. U autozomálně dominantních onemocnění s mateřskou mutací nebo autozomálně recesivních onemocnění se očekává, že poměr mezi celkovým počtem kopií mutantní alely (M) a alely divokého typu (N) v mateřské plazmě, kterou přispívá mateřská i fetální bezbuněčná DNA být vyvážený (M=N), pokud je genotyp plodu (M/N) identický s matkou (M/N). Alelický poměr bude nevyvážený, pokud se genotyp plodu liší od genotypu matky. Pokud plod zdědil obě rodičovské alely divokého typu (N/N), došlo by k dodatečnému dávkování divoké alely v mateřské plazmě přidané z plodu, což by vedlo k nedostatečnému zastoupení v celkových kopiích mutantní alely (M<N ). Naopak, pokud plod zdědil rodičovské mutantní alely (M/M), došlo by k dodatečnému dávkování mutantní alely v mateřské plazmě přidané z plodu, což by vedlo k nadměrnému zastoupení v celkových kopiích mutantní alely (M >N). Stupeň očekávané alelické nerovnováhy v mateřské plazmě závisí na frakci DNA plodu v mateřské plazmě.

K detekci takové mutantní alelické nerovnováhy byl vyvinut přístup kvantitativní relativní mutace (RMD). Tento přístup byl aplikován na neinvazivní detekci recesivních poruch, jako je beta-talasémie a srpkovitá anémie, ale také na X-vázané poruchy, jako je hemofilie. Nicméně přímý dotaz na mutaci se zdá být obtížný - dokonce nemožný - v určitých genomových lokusech kvůli přítomnosti repetitivních sekvencí, homologních pseudogenů a nedefinovanému přeuspořádání genomu. Úspěšná klasifikace alelické nerovnováhy je navíc statisticky závislá na dostupných kopiích mutovaných a divokých alel ve vzorku krve, což brzdí velmi nízká absolutní koncentrace cfDNA. Výsledkem je, že analýza RMD je stále ve fázi ověřování konceptu, je hodnocena v omezeném počtu studií s omezeným počtem pacientů a podle znalostí zkoušejícího nebyla nikdy implementována do standardní diagnostiky.

Tyto výzvy inspirovaly alternativní řešení s nepřímou inferencí stavu mutace pomocí analýzy relativního haplotypového dávkování (RHDO). Ukázalo se, že SGD-NIPD nepřímou inferencí mutačního stavu pomocí RHDO je úspěšná pro talasémii a je nyní v klinické praxi pouze ve Spojeném království National Health Service pro cystickou fibrózu, spinální svalovou atrofii a Duchennovu svalovou dystrofii. Přestože se RHDO prokázalo jako spolehlivé, kontroly kvality a rozhodovací prahy nejsou pro klinickou implementaci důkladně řešeny.

Tým hlavního řešitele se inspiroval přístupem vyvinutým Dennisem Lo a metodologický aspekt obohatil i/ o komplexní umožnění kontroly statistických chyb; ii/ jasnou identifikací klíčových parametrů, které ovlivňují diagnostický výkon RHDO; iii/ určením výstupních vlastností ilustrujících celkovou kvalitu testu.

Všechny tyto faktory byly poté sloučeny, což vedlo ke skóre kvality a definici prahu rozhodování.

Tým hlavního výzkumníka provedl předběžnou plodnou práci zahrnující více než 90 rizikových rodin pro 5 poruch.

Celkově se pracovní postup zdá být:

Specifické: mezi průkaznými testy (tj. 92 shodných + 0 neshodných výsledků) Citlivé: 92/98 (94 %) průkazné testy, mezi všemi testy (tj. 92 průkazných shodných výsledků + 6 neprůkazných shodných výsledků) Klinicky životaschopné: doba obratu 5-6 pracovních dnů. Univerzální: použitelné pro jakýkoli mutační profil (bodová mutace, delece, duplikace, expanze tripletů atd.).

Adaptabilní: lze snadno upravit pro testování jiných SGD. Tento projekt si klade za cíl využít jedinečnou francouzskou síť spolupráce k umožnění SGD-NIPD teoreticky pro jakoukoli monogenní poruchu a jakoukoli rodinu. Vyšetřovatelé si přejí stavět na této předběžné práci a rozšířit pracovní postup na každou zájmovou chorobu pro komplexní hodnocení diagnostického výkonu SGD-NIPD. Nakonec tento společný úspěch umožní překreslit francouzskou krajinu prenatální diagnostiky.

Jednou z výhod přístupu navrhovaného v této studii je, že je cílený. Analýza RHDO a její výsledky budou specifické pro lokus DNA zapojený do rodinné poruchy a neovlivní jiné oblasti genomu. Následně nebudou vyšetřovatelé konfrontováni s etickými a sociálními problémy souvisejícími s úplným sekvenováním exomu nebo genomu v prenatálním prostředí, například problémy s poradenstvím, které vyvstávají při identifikaci variant nejistého významu nebo náhodných nálezů.

SGD-NIPD bude navrženo Multidisciplinárními centry pro prenatální diagnostiku těhotným ženám podstupujícím invazivní prenatální diagnostiku v kontextu rodinné anamnézy jednogenových poruch z důvodu rodičovské patogenní mutace v jednom z následujících genů: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 nebo ATP7A.

Náborové kapacity jsou posuzovány na základě zvážení prevalence vzácných onemocnění a činností každého spoluřešitelského centra, jak je každoročně hlášeno ve zprávě biomedicínské agentury.