単一遺伝子疾患に対する非侵襲的出生前診断の開発 (DANNIgene)

1997 年に母体血漿中の cffDNA が同定されて以来、その存在を出生前診断とスクリーニングに利用する技術が急速に発展してきました。 胎児異数性を検出するために母体血漿からの cfDNA を使用した最初の原理研究が 2008 年に発表され、その後急速に商業化されました。 現在、異数性に対する非侵襲的出生前検査 (NIPT) は、最も頻度の高い胎児トリソミーのスクリーニング検査として世界中で広く使用されています。 侵襲的検査後に陽性結果の確認が必要な非侵襲的出生前診断とは異なり、非侵襲的出生前診断 (NIPD) には、侵襲的処置を必要とせずに確定診断ができるという利点があり、またそれに伴う流産のリスクも提供されます。単一遺伝子障害 (SGD) の NIPD で発生します。

NIPDは、侵襲的検査よりも妊娠初期の妊娠7週目から実施できます。 これにより、親の不安が軽減され、意思決定と計画のための時間がより多く取れるようになります。 実際、SGD-NIPD には克服すべき大きな課題があります。 i) 妊娠約 4 週間から胎盤から放出される循環 cffDNA は、母体血漿中の循環 cffDNA の総量のわずか 5% ～ 20% を占めます。 この割合は妊娠とともに増加し、母体の体重、喫煙、子癇前症などの妊娠合併症などの要因に影響されます。 したがって、胎児 DNA の変異を検出するには、最適化された技術と高感度の検出アプローチが必要です。 ii/ 十分なレベルの cffDNA が存在することを確認し、偽陰性の結果を避けるために、胎児分画を計算する必要があります。 iii/ もう 1 つの問題は、cffDNA のフラグメント長が短いことであり、そのためトリプレットリピートや大きな欠失または重複の検出が困難になります。

胎児の性決定と胎児のアカゲザルDの状態に加えて、主任研究者のチームは、胎児DNAの変異が容易に検出できる新規変異または父性遺伝変異によって引き起こされる常染色体疾患に対して、フランスの臨床現場で使用するSGD-NIPDを初めて提案した。母親の cfDNA のバックグラウンドが高いことで区別されます。 ドロップレット デジタル ポリメラーゼ連鎖反応または次世代シーケンスを使用して、単一の変異をターゲットにしてこの分析を行うことができます。

ただし、このアプローチは変異特異的な開発を必要とし、母親の DNA に存在しない点変異に限定されます。 X 染色体関連疾患、および両親が同じ変異の保因者である常染色体優性母性遺伝または常染色体劣性疾患に対する NIPD は、より大きな課題を引き起こしています。 母親の突然変異の胎児への遺伝を確認するには、定量的なアプローチが必要です。 母体の突然変異を伴う常染色体優性疾患または常染色体劣性疾患では、母体血漿中の変異型対立遺伝子 (M) と野生型対立遺伝子 (N) の総コピー数の比率は、母体と胎児の両方の無細胞 DNA によって寄与されると予想されます。胎児の遺伝子型 (M/N) が母親の遺伝子型 (M/N) と同一であれば、バランスが取れています (M=N)。 ただし、胎児の遺伝子型が母親の遺伝子型と異なる場合、対立遺伝子比の不均衡が生じます。 胎児が親の野生型対立遺伝子を両方とも受け継いでいる場合 (N/N)、母体血漿中には胎児からの野生型対立遺伝子の追加投与量が存在し、その結果、変異型対立遺伝子の総コピー数が過小評価されることになります (M<N) ）。 逆に、胎児が親の変異型対立遺伝子を受け継いでいる場合 (M/M)、母体血漿中には胎児からの追加の変異型対立遺伝子が存在し、その結果、変異型対立遺伝子 (M) の総コピー数が過剰になります。 >N）。 母体血漿中の予想される対立遺伝子の不均衡の程度は、母体血漿中の DNA 胎児分画に依存します。

このような突然変異体対立遺伝子の不均衡を検出するために、定量的相対突然変異量 (RMD) アプローチが開発されました。 このアプローチは、ベータサラセミアや鎌状赤血球貧血などの劣性疾患の非侵襲的検出に適用されているだけでなく、血友病などの X 染色体関連疾患にも適用されています。 それにもかかわらず、特定のゲノム遺伝子座では、反復配列、相同偽遺伝子、および未定義のゲノム再構成が存在するため、突然変異を直接調べることは困難、さらには不可能であると思われます。 さらに、対立遺伝子の不均衡の分類の成功は、血液サンプル中の変異型および野生型対立遺伝子の利用可能なコピーに統計的に依存しており、cfDNA の絶対濃度が非常に低いために妨げられます。 その結果、RMD 分析はまだ概念実証の段階にあり、限られた数の患者を対象とした限られた数の研究で評価されており、研究者の知る限り標準治療の診断に導入されたことはありません。

これらの課題は、相対ハプロタイプ投与量分析 (RHDO) による間接的な突然変異状態の推論を使用した代替ソリューションを発想させました。 RHDO による間接的な変異状態推論による SGD-NIPD は、サラセミアに対して効果があることが示されており、現在、嚢胞性線維症、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対して英国国民保健サービスのみで臨床実施されています。 RHDO は信頼性が証明されていますが、品質管理と判定しきい値は臨床実装に向けて十分に対処されていません。

主任研究者のチームは、デニス・ローによって開発されたアプローチからインスピレーションを得て、統計的誤差を包括的に制御できるようにすることで方法論の側面を強化しました。 ii/ RHDO の診断パフォーマンスに影響を与える重要なパラメータを明確に特定することによって。 iii/ テストの全体的な品質を示す出力特徴を正確に特定することによって。

これらすべての要素が統合され、品質スコアと決定閾値の定義が得られました。

5つの疾患のリスクにさらされている90人以上の家族を対象とした予備的な実りある研究が、主任研究者のチームによって実施された。

全体として、ワークフローは次のようになります。

特定: 決定的な検査のうち、92/92 (100%) の胎児遺伝子型が正しく特定されました (つまり、 92 件の一致 + 0 件の不一致の結果) 感度: すべてのテストのうち、92/98 (94%) の決定的なテスト (すなわち、 92 件の決定的な一致結果 + 6 件の不一致な一致結果) 臨床的に実行可能: 所要時間は 5 ～ 6 営業日。 ユニバーサル: あらゆる突然変異プロファイル (点突然変異、欠失、重複、トリプレット拡張など) に適用できます。

適応性: 他の SGD のテスト用に簡単に変更できます。 このプロジェクトは、フランスの独自の協力ネットワークを活用して、理論的にはあらゆる単一遺伝子性疾患およびあらゆる家族に対して SGD-NIPD を可能にすることを目的としています。 研究者らは、この予備作業を基にしてワークフローを対象の各疾患に広げ、SGD-NIPD の診断性能を総合的に評価したいと考えています。 最終的には、この共同の成果により、フランスの出生前診断の状況が塗り替えられることになるでしょう。

この研究で提案されたアプローチの利点の 1 つは、対象が絞られているということです。 RHDO 分析とその結果は、家族性疾患に関与する DNA 遺伝子座に特異的であり、ゲノムの他の領域には影響しません。 引き続き、研究者は、出生前環境における完全なエクソームまたはゲノム配列決定を取り巻く倫理的および社会的問題、たとえば、重要性が不確かな変異体や偶発的所見の特定を通じて生じるカウンセリングの問題に直面することはありません。

SGD-NIPD は、次の遺伝子のいずれかにおける親の病原性変異による単一遺伝子障害の家族歴を背景に、侵襲的出生前診断を受ける妊婦に対して、学際的出生前診断センターによって提案されます。 SMN1、DMPK、DMD、NF1、HTT、F8、F9、GCK、L1CAM、PKHD1、または ATP7A。

募集能力は、生物医学機関の報告書で毎年報告されている希少疾患の有病率と各共同研究センターの活動を考慮して評価されます。