Développement d'un diagnostic prénatal non invasif pour les troubles monogéniques (DANNIgene)

Depuis l’identification de l’ADNcff dans le plasma maternel en 1997, l’exploitation de sa présence pour le diagnostic et le dépistage prénatals a connu des développements rapides. Les premières études de preuve de principe utilisant le cfDNA provenant du plasma maternel pour détecter l'aneuploïdie fœtale ont été publiées en 2008, après quoi la commercialisation a été rapide. De nos jours, le test prénatal non invasif (NIPT) des aneuploïdies est largement utilisé dans le monde comme test de dépistage des trisomies fœtales les plus fréquentes. Contrairement aux tests prénatals non invasifs, où un résultat positif nécessite une confirmation suite à un test invasif, le diagnostic prénatal non invasif (NIPD) offre l'avantage d'un diagnostic définitif sans procédure invasive - et son risque de fausse couche associé - car le mosaïcisme placentaire confiné ne le fait pas. surviennent avec le NIPD pour les troubles monogéniques (SGD).

Le NIPD peut être proposé plus tôt dans la grossesse que les tests invasifs, à partir de 7 semaines de gestation. Cela peut réduire l’anxiété des parents et leur accorder plus de temps pour la prise de décision et la planification. En effet, il y a des défis importants à relever pour le SGD-NIPD. i/ L'ADNcff circulant, qui est libéré du placenta à partir d'environ 4 semaines de gestation, ne représente que 5 à 20 % de l'ADNcff circulant total dans le plasma maternel. Ce pourcentage augmente avec la gestation et est influencé par des facteurs tels que le poids maternel, le tabagisme et les complications de la grossesse telles que la prééclampsie. Par conséquent, des techniques optimisées et des approches de détection très sensibles sont nécessaires pour détecter les variantes de l’ADN fœtal. ii/ la fraction fœtale doit être calculée pour confirmer qu'il y a des niveaux suffisants d'ADNcff présents et pour éviter des résultats faussement négatifs. iii/ Un autre problème est la courte longueur des fragments de l'ADNcff, qui rend difficile la détection des répétitions de triplet et des délétions ou duplications importantes.

Outre la détermination du sexe fœtal et le statut Rhésus D fœtal, l'équipe du chercheur principal a été la première à proposer l'utilisation du SGD-NIPD en pratique clinique en France pour les troubles autosomiques provoqués par des mutations de novo ou héréditaires du père, pour lesquelles des variantes de l'ADN fœtal peuvent facilement être distingué dans le fond élevé de cfDNA maternel. La réaction en chaîne par polymérase numérique par gouttelettes ou le séquençage de nouvelle génération peuvent être utilisés pour cibler une seule mutation pour cette analyse.

Cependant, cette approche nécessite des développements spécifiques aux mutations et se limite aux mutations ponctuelles absentes de l’ADN maternel. Le NIPD pour les troubles liés à l'X, ainsi que les troubles autosomiques dominants héréditaires de la mère ou autosomiques récessifs pour lesquels les deux parents sont porteurs de la même mutation, ont posé un défi plus important. Une approche quantitative est nécessaire pour déterminer la transmission fœtale de la mutation maternelle. Dans les maladies autosomiques dominantes avec mutation maternelle ou les maladies autosomiques récessives, le rapport entre le nombre total de copies de l'allèle mutant (M) et de l'allèle de type sauvage (N) dans le plasma maternel apporté par l'ADN acellulaire maternel et fœtal devrait être équilibré (M=N) si le génotype du fœtus (M/N) est identique à celui de la mère (M/N). Cependant, le rapport allélique sera déséquilibré si le génotype fœtal est différent du génotype maternel. Si le fœtus a hérité des deux allèles parentaux de type sauvage (N/N), il y aurait une dose supplémentaire de l'allèle de type sauvage dans le plasma maternel provenant du fœtus, ce qui entraînerait une sous-représentation dans le nombre total de copies de l'allèle mutant (M<N ). À l’inverse, si le fœtus a hérité des allèles mutants parentaux (M/M), il y aurait une dose supplémentaire de l’allèle mutant dans le plasma maternel provenant du fœtus, ce qui entraînerait une surreprésentation dans le nombre total de copies de l’allèle mutant (M). >N). Le degré de déséquilibre allélique attendu dans le plasma maternel dépend de la fraction d'ADN fœtal dans le plasma maternel.

Une approche quantitative de dosage relatif de mutation (RMD) a été développée pour détecter un tel déséquilibre allélique mutant. Cette approche a été appliquée à la détection non invasive de troubles récessifs tels que la bêta-thalassémie et la drépanocytose, mais également de troubles liés à l'X comme l'hémophilie. Néanmoins, l’interrogation directe de la mutation semble difficile, voire impossible, dans certains loci génomiques en raison de la présence de séquences répétitives, de pseudogènes homologues et de réarrangements génomiques non définis. De plus, la classification réussie du déséquilibre allélique dépend statistiquement des copies disponibles d’allèles mutants et sauvages dans l’échantillon de sang, entravée par la très faible concentration absolue de cfDNA. En conséquence, l'analyse RMD est encore en phase de validation de principe, en cours d'évaluation dans un nombre limité d'études, avec un nombre limité de patients, et n'a jamais été mise en œuvre dans le diagnostic de soins standard à la connaissance des enquêteurs.

Ces défis ont inspiré une solution alternative avec une inférence indirecte du statut mutationnel par analyse relative du dosage des haplotypes (RHDO). SGD-NIPD par inférence indirecte du statut mutationnel par RHDO s'est avéré efficace pour la -thalassémie et est désormais en pratique clinique uniquement au sein du National Health Service du Royaume-Uni pour la mucoviscidose, l'amyotrophie musculaire spinale et la dystrophie musculaire de Duchenne. Bien que le RHDO se soit révélé fiable, les contrôles de qualité et les seuils décisionnels ne sont pas soigneusement pris en compte pour la mise en œuvre clinique.

L'équipe du chercheur principal s'est inspirée de l'approche développée par Dennis Lo et a enrichi l'aspect méthodologique i/ en permettant de contrôler globalement les erreurs statistiques ; ii/ en identifiant distinctement les paramètres clés qui influencent la performance diagnostique du RHDO ; iii/ en identifiant les caractéristiques de sortie illustrant la qualité globale du test.

Tous ces facteurs ont ensuite été fusionnés, aboutissant à des scores de qualité et à une définition de seuil de décision.

Un travail préliminaire fructueux impliquant plus de 90 familles à risque pour 5 pathologies a été mené par l'équipe de l'investigateur principal.

Au total, le flux de travail semble être :

Spécifique : 92/92 (100 %) génotype fœtal correctement identifié, parmi les tests concluants (c.-à-d. 92 résultats concordants + 0 résultats discordants) Sensible : 92/98 (94%) tests concluants, parmi tous les tests (soit 92 résultats concordants concluants + 6 résultats concordants non concluants) Cliniquement viable : délai d'exécution de 5 à 6 jours ouvrés. Universel : applicable à tout profil mutationnel (mutation ponctuelle, délétion, duplication, expansion triplet, etc.).

Adaptable : peut être facilement modifié pour tester d’autres SGD. Le présent projet vise à tirer parti du réseau collaboratif français unique pour rendre le SGD-NIPD possible pour théoriquement n'importe quel trouble monogénique et n'importe quelle famille. Les enquêteurs souhaitent s'appuyer sur ces travaux préliminaires pour élargir le flux de travail à chaque maladie d'intérêt pour une évaluation complète des performances diagnostiques du SGD-NIPD. A terme, cette réalisation collaborative permettra de redessiner le paysage français du diagnostic prénatal.

L’un des avantages de l’approche proposée dans cette étude est qu’elle est ciblée. L'analyse RHDO et son résultat seront spécifiques du locus ADN impliqué dans le trouble familial, et n'affecteront pas les autres régions du génome. Consécutivement, les enquêteurs ne seront pas confrontés aux problèmes éthiques et sociaux entourant le séquençage complet de l'exome ou du génome dans le cadre prénatal, par exemple les problèmes de conseil qui surviennent lors de l'identification de variantes d'importance incertaine ou de découvertes fortuites.

Le SGD-NIPD sera proposé par les Centres Multidisciplinaires de Diagnostic Prénatal aux femmes enceintes bénéficiant d'un diagnostic prénatal invasif dans un contexte d'antécédents familiaux de troubles monogéniques en raison de mutations pathogènes parentales dans l'un des gènes suivants : HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 ou ATP7A.

Les capacités de recrutement sont évaluées en considérant la prévalence des maladies rares et les activités de chaque centre co-investigateur telles que rapportées annuellement dans le rapport de l'agence de biomédecine.