Desenvolvimento de diagnóstico pré-natal não invasivo para doenças de um único gene (DANNIgene)

Desde a identificação do cffDNA no plasma materno em 1997, tem havido rápidos desenvolvimentos na exploração da sua presença para diagnóstico e rastreio pré-natal. Os primeiros estudos de prova de princípio usando cfDNA de plasma materno para detectar aneuploidia fetal foram publicados em 2008, após o que houve rápida comercialização. Hoje em dia, o teste pré-natal não invasivo (NIPT) para aneuploidias é amplamente utilizado em todo o mundo como teste de rastreio das trissomias fetais mais frequentes. Ao contrário dos testes pré-natais não invasivos, onde um resultado positivo requer confirmação após um teste invasivo, o diagnóstico pré-natal não invasivo (NIPD) oferece a vantagem de um diagnóstico definitivo sem um procedimento invasivo - e o risco de aborto espontâneo associado - porque o mosaicismo placentário confinado não ocorrem com NIPD para distúrbios de gene único (SGD).

O NIPD pode ser oferecido mais cedo na gravidez do que os testes invasivos, a partir das 7 semanas de gestação. Isto pode reduzir a ansiedade dos pais e permite mais tempo para tomada de decisões e planejamento. Na verdade, existem desafios substanciais a superar para o SGD-NIPD. i/ O cffDNA circulante, que é liberado da placenta a partir de cerca de 4 semanas de gestação, representa apenas 5% a 20% do total de cfDNA circulante no plasma materno. Esse percentual aumenta com a gestação e é influenciado por fatores como peso materno, tabagismo e complicações na gravidez, como pré-eclâmpsia. Consequentemente, são necessárias técnicas otimizadas e abordagens de detecção altamente sensíveis para detectar variantes no DNA fetal. A fração ii/fetal deve ser calculada para confirmar que há níveis suficientes de cffDNA presentes e para evitar resultados falsos negativos. iii/ Outro problema é o comprimento curto do fragmento de cffDNA, o que torna desafiadora a detecção de repetições triplas e grandes deleções ou duplicações.

Além da determinação do sexo fetal e do status fetal de Rhesus D, a equipe do investigador principal foi a primeira a propor o SGD-NIPD para uso na prática clínica na França para distúrbios autossômicos causados ​​por mutações de novo ou herdadas paternamente, para as quais variantes no DNA fetal podem facilmente ser distinguido no alto histórico do cfDNA materno. A reação em cadeia da polimerase digital em gotículas ou o sequenciamento de próxima geração podem ser usados ​​para direcionar uma única mutação para esta análise.

No entanto, esta abordagem requer desenvolvimentos específicos para mutações e está restrita a mutações pontuais que estão ausentes no DNA materno. A NIPD para doenças ligadas ao X, bem como doenças autossómicas dominantes, herdadas pela mãe ou autossómicas recessivas, para as quais ambos os pais são portadores da mesma mutação, representa um desafio maior. Uma abordagem quantitativa é necessária para determinar a herança fetal da mutação materna. Em doenças autossômicas dominantes com mutação materna ou doenças autossômicas recessivas, espera-se que a proporção entre as cópias totais do alelo mutante (M) e o alelo de tipo selvagem (N) no plasma materno contribuído pelo DNA livre de células maternas e fetais seja ser balanceado (M=N) se o genótipo do feto (M/N) for idêntico ao da mãe (M/N). No entanto, a proporção alélica estará desequilibrada se o genótipo fetal for diferente do genótipo materno. Se o feto herdou ambos os alelos parentais de tipo selvagem (N/N), haveria dosagem adicional do alelo de tipo selvagem no plasma materno contribuído pelo feto, resultando em sub-representação nas cópias totais do alelo mutante (M<N ). Por outro lado, se o feto herdou os alelos mutantes parentais (M/M), haveria dosagem adicional do alelo mutante no plasma materno contribuído pelo feto, resultando em representação excessiva nas cópias totais do alelo mutante (M >N). O grau de desequilíbrio alélico esperado no plasma materno depende da fração fetal de DNA no plasma materno.

Uma abordagem quantitativa de dosagem de mutação relativa (RMD) foi desenvolvida para detectar tal desequilíbrio alélico mutante. Esta abordagem tem sido aplicada à detecção não invasiva de doenças recessivas, como beta-talassemia e anemia falciforme, mas também para doenças ligadas ao X, como a hemofilia. No entanto, a interrogação direta da mutação parece ser difícil - até mesmo impossível - em certos loci genômicos devido à presença de sequências repetitivas, pseudogenes homólogos e rearranjo genômico indefinido. Além disso, a classificação bem-sucedida do desequilíbrio alélico depende estatisticamente das cópias disponíveis de alelos mutantes e de tipo selvagem na amostra de sangue, dificultada pela concentração absoluta muito baixa de cfDNA. Como resultado, a análise do RMD ainda está em fase de prova de conceito, sendo avaliada em um número limitado de estudos, com um número limitado de pacientes, e nunca foi implementada no diagnóstico de cuidados padrão, até onde o investigador sabe.

Esses desafios inspiraram uma solução alternativa com inferência indireta do status mutacional por análise de dosagem relativa de haplótipos (RHDO). O SGD-NIPD por inferência indireta do status mutacional por RHDO demonstrou ser bem-sucedido para a talassemia e agora está na prática clínica apenas no Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido para fibrose cística, atrofia muscular espinhal e distrofia muscular de Duchenne. Embora o RHDO tenha se mostrado confiável, os controles de qualidade e os limites de decisão não são totalmente abordados para implementação clínica.

A equipe do investigador principal inspirou-se na abordagem desenvolvida por Dennis Lo e enriqueceu o aspecto metodológico ao permitir o controle abrangente dos erros estatísticos; ii/ identificando claramente os principais parâmetros que influenciam o desempenho do diagnóstico do RHDO; iii/ identificando características de saída que ilustram a qualidade geral do teste.

Todos esses fatores foram então mesclados, resultando em índices de qualidade e definição de limites de decisão.

Um trabalho preliminar frutífero envolvendo mais de 90 famílias em risco para 5 distúrbios foi conduzido pela equipe do investigador principal.

Ao todo, o fluxo de trabalho parece ser:

Específico: 92/92 (100%) genótipo fetal identificado corretamente, entre testes conclusivos (ou seja, 92 resultados concordantes + 0 resultados discordantes) Sensível: 92/98 (94%) testes conclusivos, entre todos os testes (ou seja, 92 resultados concordantes conclusivos + 6 resultados concordantes inconclusivos) Clinicamente viável: prazo de entrega de 5-6 dias úteis. Universal: aplicável a qualquer perfil mutacional (mutação pontual, deleção, duplicação, expansão tripla etc.).

Adaptável: pode ser facilmente modificado para teste de outros SGDs. O presente projeto visa aproveitar a rede colaborativa francesa única para tornar o SGD-NIPD possível para, teoricamente, qualquer distúrbio monogênico e qualquer família. Os investigadores desejam aproveitar este trabalho preliminar para ampliar o fluxo de trabalho para cada doença de interesse para uma avaliação abrangente do desempenho diagnóstico do SGD-NIPD. Eventualmente, esta conquista colaborativa permitirá redesenhar o panorama francês do diagnóstico pré-natal.

Uma vantagem da abordagem proposta neste estudo é que ela é direcionada. A análise RHDO e seu resultado serão específicos do locus do DNA envolvido no distúrbio familiar e não afetarão outras regiões do genoma. Consecutivamente, os investigadores não serão confrontados com questões éticas e sociais relacionadas com o exoma completo ou a sequenciação do genoma no contexto pré-natal, por exemplo, as questões de aconselhamento que surgem através da identificação de variantes de significado incerto ou resultados incidentais.

O SGD-NIPD será proposto pelos Centros Multidisciplinares de Diagnóstico Pré-Natal para mulheres grávidas submetidas a diagnóstico pré-natal invasivo em um contexto de história familiar de doenças monogênicas devido a mutações patogênicas parentais em um dos seguintes genes: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 ou ATP7A.

As capacidades de recrutamento são avaliadas tendo em conta a prevalência de doenças raras e as atividades de cada centro co-investigador, conforme relatado anualmente no relatório da agência de biomedicina.