Развитие неинвазивной пренатальной диагностики моногенных заболеваний (DANNIgene)

С момента выявления вкДНК в материнской плазме в 1997 году произошли быстрые изменения в использовании ее присутствия для пренатальной диагностики и скрининга. Первые доказательства принципиальных исследований с использованием вкДНК из материнской плазмы для выявления анеуплоидии плода были опубликованы в 2008 году, после чего произошла быстрая коммерциализация. В настоящее время во всем мире широко используется неинвазивное пренатальное тестирование (НИПТ) на анеуплоидии в качестве скринингового теста на наиболее частые трисомии плода. В отличие от неинвазивного пренатального тестирования, где положительный результат требует подтверждения после инвазивного теста, неинвазивная пренатальная диагностика (НИПД) дает преимущество точного диагноза без инвазивной процедуры – и связанного с ней риска выкидыша – поскольку ограниченный плацентарный мозаицизм не возникают при NIPD при моногенных расстройствах (SGD).

NIPD может быть предложен на ранних сроках беременности, чем инвазивное тестирование, начиная с 7 недель беременности. Это может уменьшить беспокойство родителей и дать больше времени для принятия решений и планирования. Действительно, перед SGD-NIPD предстоит преодолеть существенные проблемы. i/ Циркулирующая вкДНК, которая высвобождается из плаценты примерно на 4 неделе беременности, составляет лишь 5–20% от общего количества циркулирующей вкДНК в плазме матери. Этот процент увеличивается по мере беременности и зависит от таких факторов, как вес матери, курение и осложнения беременности, такие как преэклампсия. Следовательно, для обнаружения вариантов ДНК плода необходимы оптимизированные методы и высокочувствительные подходы к обнаружению. ii/ фракцию плода необходимо рассчитать, чтобы подтвердить наличие достаточного уровня вкДНК и избежать ложноотрицательных результатов. iii/ Еще одной проблемой является короткая длина фрагмента вкфДНК, что затрудняет обнаружение триплетных повторов и крупных делеций или дупликаций.

Помимо определения пола плода и резус-статуса плода, группа главного исследователя была первой, кто предложил использовать SGD-NIPD в клинической практике во Франции при аутосомных заболеваниях, вызванных de novo или наследственными отцовскими мутациями, при которых варианты в ДНК плода могут быть легко идентифицированы. выделяется на высоком фоне материнской вкДНК. Для определения одной мутации для этого анализа можно использовать капельно-цифровую полимеразную цепную реакцию или секвенирование следующего поколения.

Однако этот подход требует разработки, специфичной для мутаций, и ограничен точечными мутациями, отсутствующими в материнской ДНК. НИПД при Х-сцепленных заболеваниях, а также аутосомно-доминантных, наследуемых по материнской линии или аутосомно-рецессивных заболеваниях, при которых оба родителя являются носителями одной и той же мутации, представляет собой более серьезную проблему. Для установления наследования материнской мутации плодом необходим количественный подход. Ожидается, что при аутосомно-доминантных заболеваниях с материнской мутацией или аутосомно-рецессивных заболеваниях соотношение общего количества копий мутантного аллеля (M) и аллеля дикого типа (N) в материнской плазме, вносимого как материнской, так и бесклеточной ДНК плода, будет быть сбалансированным (M=N), если генотип плода (M/N) идентичен материнскому (M/N). Однако соотношение аллелей будет несбалансированным, если генотип плода отличается от генотипа матери. Если плод унаследовал оба родительских аллеля дикого типа (N/N), в материнскую плазму будет введена дополнительная доза аллеля дикого типа, полученная от плода, что приведет к недостаточной представленности в общем количестве копий мутантного аллеля (M<N ). И наоборот, если плод унаследовал родительские мутантные аллели (M/M), в материнской плазме будет введена дополнительная доза мутантного аллеля, полученная от плода, что приведет к чрезмерному представлению общего количества копий мутантного аллеля (M/M). >Н). Степень ожидаемого аллельного дисбаланса в материнской плазме зависит от фракции ДНК плода в материнской плазме.

Для обнаружения такого мутантного аллельного дисбаланса был разработан подход количественной относительной дозы мутации (RMD). Этот подход был применен для неинвазивного выявления рецессивных заболеваний, таких как бета-талассемия и серповидно-клеточная анемия, а также для Х-сцепленных заболеваний, таких как гемофилия. Тем не менее, прямое исследование мутации в некоторых геномных локусах затруднено — даже невозможно — из-за присутствия повторяющихся последовательностей, гомологичных псевдогенов и неопределенных геномных перестроек. Более того, успешная классификация аллельного дисбаланса статистически зависит от доступных копий мутантных аллелей и аллелей дикого типа в образце крови, чему препятствует очень низкая абсолютная концентрация вкДНК. В результате анализ RMD все еще находится на стадии проверки концепции, оценивается в ограниченном количестве исследований с ограниченным числом пациентов и, насколько известно исследователям, никогда не применялся в стандартной диагностике.

Эти проблемы вдохновили на альтернативное решение с косвенным определением мутационного статуса с помощью анализа дозы относительного гаплотипа (RHDO). SGD-NIPD, полученный с помощью косвенного определения мутационного статуса с помощью RHDO, оказался успешным при талассемии и в настоящее время используется в клинической практике только в Национальной службе здравоохранения Соединенного Королевства для лечения муковисцидоза, спинальной мышечной атрофии и мышечной дистрофии Дюшенна. Хотя RHDO доказала свою надежность, контроль качества и пороговые значения для принятия решений не учитываются тщательно при клиническом внедрении.

Команда главного исследователя вдохновилась подходом, разработанным Деннисом Ло, и обогатила методологический аспект, т.е. всесторонне разрешив контролировать статистические ошибки; ii/ путем четкого определения ключевых параметров, влияющих на эффективность диагностики RHDO; iii/ путем точного определения выходных характеристик, иллюстрирующих общее качество теста.

Все эти факторы затем были объединены, что привело к получению показателей качества и определению порога принятия решения.

Группа главного исследователя провела предварительную плодотворную работу с участием более 90 семей из группы риска по 5 расстройствам.

В целом рабочий процесс выглядит так:

Специфичность: 92/92 (100%) генотип плода правильно идентифицирован среди окончательных тестов (т.е. 92 согласованных + 0 несогласованных результатов) Чувствительные: 92/98 (94%) окончательных тестов среди всех тестов (т.е. 92 окончательных согласующихся результата + 6 неубедительных согласующихся результатов) Клинически жизнеспособный: срок выполнения 5-6 рабочих дней. Универсальный: применим к любому мутационному профилю (точечная мутация, делеция, дупликация, триплетная экспансия и т. д.).

Адаптируемость: можно легко модифицировать для тестирования других SGD. Целью настоящего проекта является использование уникальной французской сети сотрудничества, чтобы сделать SGD-NIPD теоретически возможным для любого моногенного расстройства и любой семьи. Исследователи хотят опираться на эту предварительную работу, чтобы расширить рабочий процесс для каждого интересующего заболевания и всесторонней оценки диагностической эффективности SGD-NIPD. В конечном итоге это совместное достижение позволит перекроить французскую картину пренатальной диагностики.

Одним из преимуществ подхода, предложенного в данном исследовании, является его целенаправленность. Анализ RHDO и его результат будут специфичны для локуса ДНК, вовлеченного в семейное расстройство, и не будут влиять на другие области генома. Следовательно, исследователи не столкнутся с этическими и социальными проблемами, связанными с полным секвенированием экзома или генома в пренатальном периоде, например, с проблемами консультирования, которые возникают в результате выявления вариантов неопределенного значения или случайных находок.

SGD-NIPD будет предложен многопрофильными центрами пренатальной диагностики беременным женщинам, проходящим инвазивную пренатальную диагностику в контексте семейного анамнеза моногенных заболеваний из-за родительских патогенных мутаций в одном из следующих генов: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 или ATP7A.

Возможности набора персонала оцениваются с учетом распространенности редких заболеваний и деятельности каждого центра совместных исследований, о чем ежегодно сообщается в отчете биомедицинского агентства.