Desarrollo de diagnóstico prenatal no invasivo para trastornos de un solo gen (DANNIgene)

Desde la identificación del ADNcff en el plasma materno en 1997, ha habido rápidos avances en la explotación de su presencia para el diagnóstico y la detección prenatal. Los primeros estudios de prueba de principio que utilizaron cfDNA del plasma materno para detectar aneuploidía fetal se publicaron en 2008, tras lo cual hubo una rápida comercialización. Hoy en día, las pruebas prenatales no invasivas (NIPT) para aneuploidías se utilizan ampliamente en todo el mundo como prueba de detección de las trisomías fetales más frecuentes. A diferencia de las pruebas prenatales no invasivas, donde un resultado positivo requiere confirmación después de una prueba invasiva, el diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD) ofrece la ventaja de un diagnóstico definitivo sin un procedimiento invasivo (y su riesgo de aborto espontáneo asociado) porque el mosaicismo placentario confinado no ocurren con NIPD para trastornos de un solo gen (SGD).

La NIPD se puede ofrecer en una etapa más temprana del embarazo que las pruebas invasivas, a partir de las 7 semanas de gestación. Esto puede reducir la ansiedad de los padres y permitir más tiempo para la toma de decisiones y la planificación. De hecho, existen desafíos sustanciales que superar para SGD-NIPD. i/ El ADNcff circulante, que se libera de la placenta aproximadamente a las 4 semanas de gestación, constituye sólo entre el 5% y el 20% del ADNcf total circulante en el plasma materno. Este porcentaje aumenta con la gestación y está influenciado por factores como el peso materno, el tabaquismo y complicaciones del embarazo como la preeclampsia. En consecuencia, se requieren técnicas optimizadas y enfoques de detección altamente sensibles para detectar variantes en el ADN fetal. ii/ la fracción fetal debe calcularse para confirmar que hay niveles suficientes de cffDNA presentes y evitar resultados falsos negativos. iii/ Otro problema es la corta longitud de los fragmentos de cffDNA, lo que dificulta la detección de repeticiones de tripletes y grandes eliminaciones o duplicaciones.

Además de la determinación del sexo fetal y del estado de Rhesus D fetal, el equipo del investigador principal fue el primero en proponer el uso del SGD-NIPD en la práctica clínica en Francia para trastornos autosómicos causados ​​por mutaciones de novo o heredadas por el padre, para las cuales se pueden identificar fácilmente variantes en el ADN fetal. distinguido en el alto fondo de cfDNA materno. La reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas o la secuenciación de próxima generación se pueden utilizar para apuntar a una única mutación para este análisis.

Sin embargo, este enfoque requiere desarrollos específicos de mutaciones y se limita a mutaciones puntuales que están ausentes en el ADN materno. La NIPD para los trastornos ligados al cromosoma X, así como los trastornos autosómicos dominantes heredados por vía materna o autosómicos recesivos en los que ambos padres son portadores de la misma mutación, ha planteado un desafío mayor. Se necesita un enfoque cuantitativo para determinar la herencia fetal de la mutación materna. En enfermedades autosómicas dominantes con mutación materna o enfermedades autosómicas recesivas, se espera que la proporción entre las copias totales del alelo mutante (M) y el alelo de tipo salvaje (N) en el plasma materno aportadas por el ADN libre de células materno y fetal aumente. estar equilibrado (M=N) si el genotipo del feto (M/N) es idéntico al de la madre (M/N). Sin embargo, la proporción alélica estará desequilibrada si el genotipo fetal es diferente del genotipo materno. Si el feto ha heredado ambos alelos parentales de tipo salvaje (N/N), habría una dosis adicional del alelo de tipo salvaje en el plasma materno aportado por el feto, lo que daría como resultado una representación insuficiente en las copias totales del alelo mutante (M<N ). Por el contrario, si el feto ha heredado los alelos mutantes parentales (M/M), habría una dosis adicional del alelo mutante en el plasma materno aportado por el feto, lo que daría como resultado una representación excesiva en las copias totales del alelo mutante (M >N). El grado de desequilibrio alélico esperado en el plasma materno depende de la fracción de ADN fetal en el plasma materno.

Se ha desarrollado un enfoque cuantitativo de dosis relativa de mutación (RMD) para detectar dicho desequilibrio alélico mutante. Este enfoque se ha aplicado a la detección no invasiva de trastornos recesivos como la beta-talasemia y la anemia falciforme, pero también para trastornos ligados al cromosoma X como la hemofilia. Sin embargo, la interrogación directa de la mutación parece difícil, incluso imposible, en ciertos loci genómicos debido a la presencia de secuencias repetitivas, pseudogenes homólogos y reordenamiento genómico indefinido. Además, la clasificación exitosa del desequilibrio alélico depende estadísticamente de las copias disponibles de alelos mutantes y de tipo salvaje en la muestra de sangre, lo que se ve obstaculizado por la muy baja concentración absoluta de cfDNA. Como resultado, el análisis RMD aún se encuentra en una fase de prueba de concepto, se está evaluando en un número limitado de estudios, con un número limitado de pacientes y, hasta donde saben los investigadores, nunca se ha implementado en el diagnóstico de atención estándar.

Estos desafíos han inspirado una solución alternativa con inferencia indirecta del estado mutacional mediante análisis de dosis relativa de haplotipos (RHDO). Se ha demostrado que SGD-NIPD mediante inferencia indirecta del estado mutacional mediante RHDO tiene éxito para la -talasemia y ahora se utiliza en la práctica clínica sólo en el Servicio Nacional de Salud del Reino Unido para la fibrosis quística, la atrofia muscular espinal y la distrofia muscular de Duchenne. Aunque se ha demostrado que la RHDO es confiable, los controles de calidad y los umbrales de decisión no se abordan exhaustivamente para su implementación clínica.

El equipo del investigador principal se inspiró en el enfoque desarrollado por Dennis Lo y enriqueció el aspecto metodológico i/ permitiendo controlar de manera integral los errores estadísticos; ii/ identificando claramente los parámetros clave que influyen en el desempeño del diagnóstico de RHDO; iii/ señalando las características de salida que ilustran la calidad general de la prueba.

Luego, todos estos factores se fusionaron, lo que resultó en puntuaciones de calidad y definición del umbral de decisión.

El equipo del investigador principal llevó a cabo un trabajo preliminar fructífero en el que participaron más de 90 familias en riesgo de padecer 5 trastornos.

En total, el flujo de trabajo parece ser:

Específico: 92/92 (100%) genotipo fetal correctamente identificado, entre pruebas concluyentes (es decir, 92 resultados concordantes + 0 resultados discordantes) Sensible: 92/98 (94%) pruebas concluyentes, entre todas las pruebas (es decir. 92 resultados concordantes concluyentes + 6 resultados concordantes no concluyentes) Clínicamente viable: tiempo de respuesta de 5-6 días hábiles. Universal: aplicable a cualquier perfil mutacional (mutación puntual, deleción, duplicación, expansión triplete, etc.).

Adaptable: se puede modificar fácilmente para probar otros SGD. El presente proyecto tiene como objetivo aprovechar la red colaborativa francesa única para hacer posible SGD-NIPD para teóricamente cualquier trastorno monogénico y cualquier familia. Los investigadores desean aprovechar este trabajo preliminar para ampliar el flujo de trabajo a cada enfermedad de interés para una evaluación integral del rendimiento diagnóstico de SGD-NIPD. Con el tiempo, este logro de colaboración permitirá rediseñar el panorama francés del diagnóstico prenatal.

Una ventaja del enfoque propuesto en este estudio es que está dirigido. El análisis RHDO y su resultado serán específicos del locus de ADN implicado en el trastorno familiar y no afectarán a otras regiones del genoma. En consecuencia, los investigadores no se enfrentarán a cuestiones éticas y sociales relacionadas con la secuenciación completa del exoma o del genoma en el entorno prenatal, por ejemplo, las cuestiones de asesoramiento que surgen a través de la identificación de variantes de significado incierto o hallazgos incidentales.

SGD-NIPD será propuesto por Centros Multidisciplinarios de Diagnóstico Prenatal a mujeres embarazadas sometidas a un diagnóstico prenatal invasivo en un contexto de antecedentes familiares de trastornos de un solo gen debido a mutaciones patógenas de los padres en uno de los siguientes genes: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 o ATP7A.

Las capacidades de reclutamiento se evalúan considerando la prevalencia de enfermedades raras y las actividades de cada centro de co-investigación tal como se informa anualmente en el informe de la agencia de biomedicina.