Ei-invasiivisen synnytystä edeltävän diagnoosin kehittäminen yhden geenin häiriöihin (DANNIgene)

Sen jälkeen kun cffDNA tunnistettiin äidin plasmassa vuonna 1997, sen läsnäolon hyödyntämisessä on tapahtunut nopeaa kehitystä synnytystä edeltävässä diagnoosissa ja seulonnassa. Ensimmäiset todisteet periaatteellisista tutkimuksista, joissa käytettiin äidin plasmasta peräisin olevaa cfDNA:ta sikiön aneuploidian havaitsemiseen, julkaistiin vuonna 2008, minkä jälkeen kaupallistaminen tapahtui nopeasti. Nykyään aneuploidioiden non-invasiivista prenataalista testausta (NIPT) käytetään laajalti ympäri maailmaa yleisimpien sikiön trisomioiden seulontatestinä. Toisin kuin ei-invasiiviset synnytystä edeltävät testaukset, joissa positiivinen tulos edellyttää vahvistusta invasiivisen testin jälkeen, non-invasiivinen prenataalidiagnoosi (NIPD) tarjoaa lopullisen diagnoosin etuna ilman invasiivista toimenpidettä - ja siihen liittyvän keskenmenoriskin - koska istukan rajoitettu mosaiikki ei esiintyy NIPD:n yhteydessä yhden geenin häiriöihin (SGD).

NIPD:tä voidaan tarjota aikaisemmin raskauden aikana kuin invasiivista testausta, 7 raskausviikosta alkaen. Tämä voi vähentää vanhempien ahdistusta ja antaa enemmän aikaa päätöksenteolle ja suunnittelulle. SGD-NIPD:lle on todellakin voitettava merkittäviä haasteita. i/ Kiertävä cffDNA, joka vapautuu istukasta noin 4 raskausviikolla, muodostaa vain 5–20 % kaikesta kiertävästä cfDNA:sta äidin plasmassa. Tämä prosenttiosuus kasvaa raskauden myötä, ja siihen vaikuttavat tekijät, kuten äidin paino, tupakointi ja raskauden komplikaatiot, kuten preeklampsia. Näin ollen tarvitaan optimoituja tekniikoita ja erittäin herkkiä havaitsemismenetelmiä muunnelmien havaitsemiseksi sikiön DNA:ssa. ii/ sikiöfraktio on laskettava sen varmistamiseksi, että cffDNA:ta on riittävästi, ja väärien negatiivisten tulosten välttämiseksi. iii/ Toinen ongelma on cffDNA:n lyhyt fragmenttipituus, mikä tekee triplettitoistojen ja suurten deleetioiden tai kopioiden havaitsemisesta haastavaa.

Sikiön sukupuolen määrityksen ja sikiön Rhesus D -statuksen lisäksi päätutkijaryhmä ehdotti ensimmäisenä SGD-NIPD:tä käytettäväksi kliinisessä käytännössä Ranskassa de novo tai isältä periytyvien mutaatioiden aiheuttamiin autosomaalisiin sairauksiin, joihin sikiön DNA:n muunnelmia voidaan helposti löytää. erottuu äidin cfDNA:n korkeasta taustasta. Pisaradigitaalista polymeraasiketjureaktiota tai seuraavan sukupolven sekvensointia voidaan käyttää kohdistamaan yksi mutaatio tässä analyysissä.

Tämä lähestymistapa vaatii kuitenkin mutaatiospesifistä kehitystä ja rajoittuu pistemutaatioihin, jotka puuttuvat äidin DNA:sta. X-kytkettyjen sairauksien NIPD sekä autosomaaliset dominantti äidin periytyneet tai autosomaaliset resessiiviset sairaudet, joissa molemmat vanhemmat ovat saman mutaation kantajia, ovat olleet suurempi haaste. Kvantitatiivinen lähestymistapa tarvitaan äidin mutaation sikiön periytymisen varmistamiseksi. Autosomaalisissa dominanteissa sairauksissa, joihin liittyy äidin mutaatio tai autosomaaliset resessiiviset sairaudet, sekä äidin että sikiön soluvapaan DNA:n synnyttämän mutanttialleelin (M) ja villityypin alleelin (N) kokonaiskopioiden suhteen äidin plasmassa odotetaan olevan olla tasapainoinen (M=N), jos sikiön genotyyppi (M/N) on identtinen äidin kanssa (M/N). Alleelisuhde on kuitenkin epätasapainoinen, jos sikiön genotyyppi eroaa äidin genotyypistä. Jos sikiö on perinyt molemmat vanhemman villityypin alleelit (N/N), villityypin alleelia olisi lisäannos sikiön tuottamassa äidin plasmassa, mikä johtaisi aliedustukseen mutanttialleelin kokonaiskopioissa (M<N). ). Kääntäen, jos sikiö on perinyt vanhemman mutanttialleelit (M/M), sikiöstä peräisin olevaan äidin plasmaan tulee lisäannos mutanttialleelia, mikä johtaisi yliedustukseen mutanttialleelin kokonaiskopioissa (M >N). Odotetun alleeliepätasapainon aste äidin plasmassa riippuu sikiön DNA-fraktiosta äidin plasmassa.

Kvantitatiivinen suhteellinen mutaatioannostus (RMD) on kehitetty tällaisen mutanttien alleelisen epätasapainon havaitsemiseksi. Tätä lähestymistapaa on sovellettu resessiivisten sairauksien, kuten beetatalassemian ja sirppisoluanemian, ei-invasiiviseen havaitsemiseen, mutta myös X-kytkettyjen sairauksien, kuten hemofilian, havaitsemiseen. Siitä huolimatta mutaation suora tutkiminen näyttää olevan vaikeaa - jopa mahdotonta - tietyissä genomisissa lokuksissa toistuvien sekvenssien, homologisten pseudogeenien ja määrittelemättömän genomisen uudelleenjärjestelyn vuoksi. Lisäksi alleelisen epätasapainon onnistunut luokittelu on tilastollisesti riippuvainen verinäytteessä olevista mutanttien ja villityypin alleelien kopioista, mitä haittaa cfDNA:n erittäin alhainen absoluuttinen pitoisuus. Tämän seurauksena RMD-analyysi on edelleen käsitteen testausvaiheessa, ja sitä arvioidaan rajoitetussa määrässä tutkimuksia, joissa on rajoitettu määrä potilaita, eikä sitä ole koskaan otettu käyttöön tavanomaisessa hoitodiagnoosissa tutkijan tietämyksen mukaan.

Nämä haasteet ovat inspiroineet vaihtoehtoista ratkaisua epäsuoralla mutaatiostatuspäätelmällä suhteellisella haplotyyppiannosanalyysillä (RHDO). RHDO:n epäsuoran mutaatiostatuksen perusteella tehdyn SGD-NIPD:n on osoitettu olevan onnistunut -talassemiassa, ja se on nyt kliinisessä käytännössä vain Yhdistyneen kuningaskunnan kansallisessa terveyspalvelussa kystisen fibroosin, spinaalisen lihasatrofian ja Duchennen lihasdystrofian osalta. Vaikka RHDO on osoittautunut luotettavaksi, laadunvalvontaa ja päätöksentekokynnyksiä ei käsitellä perusteellisesti kliinisessä toteutuksessa.

Päätutkijan tiimi inspiroitui Dennis Lon kehittämästä lähestymistavasta ja rikastutti metodologista puolta i/ sallimalla kattavasti tilastollisten virheiden hallinnan; ii/ tunnistamalla selkeästi avainparametrit, jotka vaikuttavat RHDO:n diagnoosin suorituskykyyn; iii/ määrittämällä testin yleistä laatua kuvaavat tulosominaisuudet.

Kaikki nämä tekijät yhdistettiin sitten, mikä johti laatupisteisiin ja päätöskynnyksen määrittelyyn.

Esitutkijan ryhmä suoritti hedelmällisen alustavan työn, johon osallistui yli 90 riskiperhettä 5 sairauden osalta.

Kaiken kaikkiaan työnkulku näyttää tältä:

Spesifinen: 92/92 (100 %) sikiön genotyyppi oikein tunnistettu lopullisten testien joukossa (esim. 92 yhtäpitävää + 0 ristiriitaista tulosta) Herkkä: 92/98 (94 %) lopullista testiä kaikkien testien joukossa (ts. 92 vakuuttavaa yhtäpitävää tulosta + 6 epäselvää yhteensopivaa tulosta) Kliinisesti elinkelpoinen: kiertoaika 5-6 työpäivää. Universaali: soveltuu mihin tahansa mutaatioprofiiliin (pistemutaatio, deleetio, duplikaatio, tripletin laajennus jne.).

Mukautuva: voidaan helposti muokata muiden SGD:iden testausta varten. Tämän projektin tavoitteena on hyödyntää ainutlaatuista ranskalaista yhteistyöverkostoa tehdäkseen SGD-NIPD:n mahdolliseksi teoreettisesti kaikille monogeenisille häiriöille ja kaikille perheille. Tutkijat haluavat hyödyntää tätä alustavaa työtä laajentaakseen työnkulkua jokaiseen kiinnostavaan sairauteen SGD-NIPD:n diagnostisen suorituskyvyn kattavaa arviointia varten. Lopulta tämä yhteistyösaavutus mahdollistaa ranskalaisen synnytystä edeltävän diagnoosin uudelleenpiirtämisen.

Yksi tässä tutkimuksessa ehdotetun lähestymistavan etu on, että se on kohdennettu. RHDO-analyysi ja sen tulos ovat spesifisiä perhehäiriöön liittyvälle DNA-lokukselle, eivätkä ne vaikuta genomin muihin alueisiin. Peräkkäin tutkijat eivät joudu kohtaamaan eettisiä ja sosiaalisia kysymyksiä, jotka liittyvät täydelliseen eksomin tai genomin sekvensointiin synnytystä edeltävässä ympäristössä, esimerkiksi neuvontakysymyksiin, joita syntyy epävarman merkityksen varianttien tai satunnaisten löydösten tunnistamisen yhteydessä.

Monitieteiset synnytysdiagnoosin keskukset ehdottavat SGD-NIPD:tä raskaana oleville naisille, joille tehdään invasiivinen synnytystä edeltävä diagnoosi, kun suvussa on esiintynyt yhden geenin häiriöitä, jotka johtuvat vanhemman patogeenisista mutaatioista jossakin seuraavista geeneistä: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 tai ATP7A.

Rekrytointivalmiuksia arvioidaan ottamalla huomioon harvinaisten sairauksien esiintyvyys ja kunkin osatutkijakeskuksen toiminta biolääketieteen laitoksen raportissa vuosittain raportoituna.