单基因疾病无创产前诊断的发展 (DANNIgene)

自 1997 年在母体血浆中鉴定出 cffDNA 以来，利用其存在进行产前诊断和筛查的工作取得了快速发展。 第一个利用母体血浆 cfDNA 检测胎儿非整倍性的原理研究于 2008 年发表，随后迅速商业化。 如今，非整倍体的无创产前检测 (NIPT) 在世界范围内广泛使用，作为最常见的胎儿三体性的筛查测试。 与非侵入性产前检测（阳性结果需要在侵入性检测后确认）不同，非侵入性产前诊断 (NIPD) 具有无需侵入性操作即可做出明确诊断的优势 - 及其相关的流产风险 - 因为局限性胎盘嵌合体不存在与单基因疾病 (SGD) 的 NIPD 一起发生。

NIPD 可以在怀孕期间比侵入性检测更早进行，即从妊娠 7 周开始。 这可以减少父母的焦虑，并留出更多时间进行决策和计划。 事实上，SGD-NIPD 面临着巨大的挑战需要克服。 i/ 循环 cffDNA 是在妊娠 4 周左右从胎盘释放的，仅占母体血浆中总循环 cfDNA 的 5%-20%。 该百分比随着妊娠而增加，并受到母亲体重、吸烟和先兆子痫等妊娠并发症等因素的影响。 因此，需要优化的技术和高度灵敏的检测方法来检测胎儿 DNA 中的变异。 ii/ 必须计算胎儿分数，以确认存在足够水平的 cffDNA 并避免假阴性结果。 iii/ 另一个问题是 cffDNA 的片段长度较短，这使得检测三联体重复和大的缺失或重复具有挑战性。

除了胎儿性别确定和胎儿恒河猴 D 状态外，首席研究员团队还第一个提议在法国将 SGD-NIPD 用于临床实践，用于治疗由新发或父系遗传突变引起的常染色体疾病，因为胎儿 DNA 中的变异很容易被检测出来。在母体 cfDNA 的高背景下区分。 液滴数字聚合酶链式反应或下一代测序可用于针对该分析的单个突变。

然而，这种方法需要突变特异性的发展，并且仅限于母体 DNA 中不存在的点突变。 X连锁疾病以及父母双方均为相同突变携带者的常染色体显性母系遗传或常染色体隐性遗传疾病的NIPD提出了更大的挑战。 需要一种定量方法来确定母体突变的胎儿遗传。 在伴有母体突变的常染色体显性遗传疾病或常染色体隐性遗传疾病中，母体血浆中由母体和胎儿游离 DNA 贡献的突变等位基因 (M) 和野生型等位基因 (N) 的总拷贝数之比预计为如果胎儿的基因型（M/N）与母亲（M/N）相同，则平衡（M=N）。 然而，如果胎儿基因型与母体基因型不同，等位基因比例就会失衡。 如果胎儿继承了父母的两个野生型等位基因（N/N），则胎儿贡献的母体血浆中会有额外剂量的野生型等位基因，导致突变等位基因的总拷贝数不足（M<N） ）。 相反，如果胎儿继承了父母的突变等位基因（M/M），则胎儿贡献的母体血浆中突变等位基因的剂量会增加，导致突变等位基因的总拷贝数过多（M） >N）。 母体血浆中预期等位基因不平衡的程度取决于母体血浆中胎儿DNA的分数。

定量相对突变剂量（RMD）方法已被开发来检测这种突变等位基因不平衡。 这种方法已应用于β-地中海贫血和镰状细胞性贫血等隐性疾病的无创检测，也适用于血友病等X连锁疾病。 然而，由于重复序列、同源假基因和未定义的基因组重排的存在，在某些基因组位点中直接询问突变似乎很困难，甚至是不可能的。 此外，等位基因不平衡的成功分类在统计上取决于血液样本中突变型和野生型等位基因的可用拷贝，这受到 cfDNA 绝对浓度极低的阻碍。 因此，RMD 分析仍处于概念验证阶段，在有限数量的研究和有限数量的患者中进行评估，并且据研究者所知从未在标准护理诊断中实施。

这些挑战激发了一种替代解决方案，即通过相对单倍型剂量分析 (RHDO) 进行间接突变状态推断。 通过 RHDO 间接突变状态推断的 SGD-NIPD 已被证明对地中海贫血是成功的，目前仅在英国国家卫生服务中心用于治疗囊性纤维化、脊髓性肌萎缩症和杜氏肌营养不良症。 尽管 RHDO 已被证明是可靠的，但临床实施的质量控制和决策阈值尚未得到彻底解决。

首席研究员团队受到 Dennis Lo 开发的方法的启发，通过全面控制统计误差，丰富了方法论方面； ii/ 通过明确识别影响 RHDO 诊断性能的关键参数； iii/ 通过精确定位输出特征来说明测试的整体质量。

然后合并所有这些因素，产生质量分数和决策阈值定义。

首席研究员团队开展了一项初步卓有成效的工作，涉及 90 多个患有 5 种疾病的高危家庭。

总而言之，工作流程似乎是：

具体：在结论性测试中（即，92/92 (100%)）胎儿基因型被正确识别。 92 个一致结果 + 0 个不一致结果） 敏感：所有测试中，92/98 (94%) 个结论性测试（即 92 个结论性一致结果 + 6 个非结论性一致结果）临床上可行：周转时间为 5-6 个工作日。 通用：适用于任何突变谱（点突变、缺失、重复、三联体扩展等）。

适应性强：可以轻松修改以测试其他 SGD。 本项目旨在利用独特的法国合作网络，使 SGD-NIPD 能够用于理论上任何单基因疾病和任何家庭。 研究人员希望在这项初步工作的基础上，将工作流程扩大到每种感兴趣的疾病，以全面评估 SGD-NIPD 的诊断性能。 最终，这一合作成果将重塑法国产前诊断的格局。

本研究提出的方法的一个优点是它具有针对性。 RHDO 分析及其结果将针对涉及家庭疾病的 DNA 位点，并且不会影响基因组的其他区域。 因此，研究人员不会面临产前环境中全外显子组或基因组测序的伦理和社会问题，例如通过识别不确定意义的变异或偶然发现而出现的咨询问题。

SGD-NIPD 将由产前诊断多学科中心向因父母以下基因之一存在单基因疾病家族史而接受侵入性产前诊断的孕妇提出：HBB、CFTR、FMR1、 SMN1、DMPK、DMD、NF1、HTT、F8、F9、GCK、L1CAM、PKHD1 或 ATP7A。

通过考虑生物医学机构每年报告中罕见疾病的患病率和每个联合研究中心的活动来评估招募能力。