Udvikling af ikke-invasiv prænatal diagnose for enkelt-gen-lidelser (DANNIgene)

Siden identifikationen af ​​cffDNA i maternel plasma i 1997 har der været en hurtig udvikling i at udnytte dets tilstedeværelse til prænatal diagnose og screening. De første principielle undersøgelser med cfDNA fra maternel plasma til at påvise føtal aneuploidi blev offentliggjort i 2008, hvorefter der skete en hurtig kommercialisering. I dag anvendes ikke-invasiv prænatal test (NIPT) for aneuploidier i vid udstrækning over hele verden som en screeningstest for de hyppigste føtale trisomier. I modsætning til non-invasiv prænatal testning, hvor et positivt resultat kræver bekræftelse efter en invasiv test, tilbyder non-invasiv prænatal diagnose (NIPD) fordelen ved en endelig diagnose uden en invasiv procedure - og dens tilhørende abortrisiko - fordi indesluttet placenta mosaicisme ikke forekomme med NIPD for enkelt-gen lidelser (SGD).

NIPD kan tilbydes tidligere i graviditeten end invasiv testning, fra 7 ugers graviditet. Dette kan reducere forældres angst og give mere tid til beslutningstagning og planlægning. Der er faktisk betydelige udfordringer at overvinde for SGD-NIPD. i/ Cirkulerende cffDNA, som frigives fra placenta fra omkring 4 ugers svangerskab, udgør kun 5%-20% af det samlede cirkulerende cfDNA i maternal plasma. Denne procentdel stiger med graviditeten og påvirkes af faktorer som moderens vægt, rygning og graviditetskomplikationer såsom præeklampsi. Som følge heraf kræves optimerede teknikker og meget følsomme detektionsmetoder for at påvise varianter i fosterets DNA. ii/ føtal fraktion skal beregnes for at bekræfte, at der er tilstrækkelige niveauer af cffDNA til stede og for at undgå falsk negative resultater. iii/ Et andet problem er den korte fragmentlængde af cffDNA, som gør detektion af tripletgentagelser og store deletioner eller duplikationer udfordrende.

Udover føtal kønsbestemmelse og føtal Rhesus D-status, var hovedforskers team det første til at foreslå SGD-NIPD til brug i klinisk praksis i Frankrig for autosomale lidelser forårsaget af de novo eller paternalt arvelige mutationer, for hvilke varianter i fosterets DNA let kan skelnes i den høje baggrund af maternel cfDNA. Dråbe-digital polymerasekædereaktion eller næste generations sekventering kan bruges til at målrette en enkelt mutation til denne analyse.

Denne tilgang kræver dog mutationsspecifikke udviklinger og er begrænset til punktmutationer, der er fraværende i moderens DNA. NIPD for X-bundne lidelser, såvel som autosomalt dominante maternalt arvelige eller autosomale recessive lidelser, hvor begge forældre er bærere af den samme mutation, har udgjort en større udfordring. En kvantitativ tilgang er nødvendig for at fastslå føtal nedarvning af den maternelle mutation. Ved autosomale dominante sygdomme med maternal mutation eller autosomale recessive sygdomme forventes forholdet mellem de samlede kopier af mutantallelen (M) og vildtypeallelen (N) i moderens plasma bidraget af både det maternelle og føtale cellefri DNA at være afbalanceret (M=N), hvis fosterets genotype (M/N) er identisk med moderen (M/N). Imidlertid vil det alleliske forhold være ubalanceret, hvis den føtale genotype er forskellig fra den maternelle genotype. Hvis fosteret har arvet begge parentale vildtype-alleler (N/N), ville der være en yderligere dosis af vildtype-allelen i moderplasmaet, der er bidraget fra fosteret, hvilket resulterer i underrepræsentation i de totale kopier af mutantallelen (M<N ). Omvendt, hvis fosteret har arvet de parentale mutante alleler (M/M), ville der være en yderligere dosis af mutantallelen i moderens plasma bidraget fra fosteret, hvilket resulterer i overrepræsentation i de samlede kopier af mutantallelen (M >N). Graden af ​​forventet allel ubalance i moderens plasma afhænger af DNA-fosterfraktionen i moderens plasma.

En kvantitativ relativ mutationsdosis (RMD) tilgang er blevet udviklet til at påvise en sådan mutant allel ubalance. Denne tilgang er blevet anvendt til ikke-invasiv påvisning af recessive lidelser såsom beta-thalassæmi og seglcelleanæmi, men også til X-bundne lidelser som hæmofili. Ikke desto mindre synes direkte forespørgsel af mutationen at være vanskelig - endda umulig - i visse genomiske loci på grund af tilstedeværelsen af ​​gentagne sekvenser, homologe pseudogener og udefineret genomisk omlejring. Desuden er vellykket klassificering af allel ubalance statistisk afhængig af de tilgængelige kopier af mutante og vildtype alleler i blodprøven, hæmmet af den meget lave absolutte koncentration af cfDNA. Som følge heraf er RMD-analyse stadig i en proof-of-concept-fase, idet den evalueres i et begrænset antal undersøgelser med et begrænset antal patienter, og er aldrig blevet implementeret i standardbehandlingsdiagnose til efterforskerens viden.

Disse udfordringer har inspireret til en alternativ løsning med indirekte mutationsstatusinferens ved relativ haplotypedosisanalyse (RHDO). SGD-NIPD ved indirekte mutationsstatusinferens af RHDO har vist sig at være vellykket for -thalassæmi og er nu kun i klinisk praksis i Storbritanniens National Health Service for cystisk fibrose, spinal muskelatrofi og Duchenne muskeldystrofi. Selvom RHDO har vist sig at være pålidelig, behandles kvalitetskontrol og beslutningstærskler ikke grundigt for klinisk implementering.

Principal investigators team blev inspireret af den tilgang udviklet af Dennis Lo og berigede det metodiske aspekt i/ ved omfattende at tillade kontrol af de statistiske fejl; ii/ ved tydeligt at identificere nøgleparametre, der påvirker diagnoseydelsen af ​​RHDO; iii/ ved at udpege outputfunktioner, der illustrerer testens overordnede kvalitet.

Alle disse faktorer blev derefter slået sammen, hvilket resulterede i kvalitetsscore og definition af beslutningstærskel.

Et foreløbigt frugtbart arbejde, der involverede mere end 90 risikofamilier for 5 lidelser, blev udført af hovedforskerens team.

Alt i alt ser arbejdsgangen ud til at være:

Specifikt: 92/92 (100%) føtal genotype korrekt identificeret blandt afgørende tests (dvs. 92 overensstemmende + 0 uenige resultater) Følsomme: 92/98 (94%) konklusive tests blandt alle tests (dvs. 92 endegyldige konkordante resultater + 6 uoverensstemmende konkordante resultater) Klinisk levedygtig: ekspeditionstid på 5-6 arbejdsdage. Universal: gælder for enhver mutationsprofil (punktmutation, deletion, duplikering, tripletudvidelse osv.).

Tilpasningsbar: kan let modificeres til test af andre SGD'er. Dette projekt har til formål at drage fordel af det unikke franske samarbejdsnetværk for at gøre SGD-NIPD muligt for teoretisk set enhver monogen lidelse og enhver familie. Efterforskerne ønsker at bygge videre på dette indledende arbejde for at udvide arbejdsgangen til hver sygdom af interesse for en omfattende evaluering af den diagnostiske ydeevne af SGD-NIPD. Til sidst vil denne samarbejdspræstation muliggøre en gentegning af det franske landskab for prænatal diagnose.

En fordel ved den fremgangsmåde, der foreslås i denne undersøgelse, er, at den er målrettet. RHDO-analysen og dens resultat vil være specifik for DNA-locus involveret i familielidelsen og vil ikke påvirke andre regioner af genomet. Efterfølgende vil efterforskere ikke blive konfronteret med etiske og sociale spørgsmål omkring fuld exom- eller genom-sekventering i prænatale omgivelser, for eksempel de rådgivningsproblemer, der opstår gennem identifikation af varianter af usikker betydning eller tilfældige fund.

SGD-NIPD vil blive foreslået af multidisciplinære centre for prænatal diagnose til gravide kvinder, der gennemgår invasiv prænatal diagnose i en sammenhæng med familiehistorie med enkelt-gen-lidelser på grund af forældrenes patogene mutationer i et af følgende gener: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 eller ATP7A.

Rekrutteringskapaciteten vurderes ved at overveje forekomsten af ​​sjældne sygdomme og aktiviteterne i hvert co-investigator center som rapporteret årligt i rapporten fra det biomedicinske agentur.