단일 유전자 질환에 대한 비침습적 산전 진단법의 개발 (DANNIgene)

1997년 모체 혈장에서 cffDNA가 확인된 이후, 산전 진단 및 선별검사를 위해 cffDNA의 존재를 활용하는 데 급속한 발전이 있었습니다. 태아의 이수성을 검출하기 위해 모체 혈장의 cfDNA를 사용한 첫 번째 원리 증명 연구는 2008년에 발표되었으며 이후 급속한 상용화가 이루어졌습니다. 요즘에는 이수성에 대한 비침습적 산전 검사(NIPT)가 가장 빈번한 태아 삼염색체에 대한 선별 검사로 전 세계적으로 널리 사용되고 있습니다. 양성 결과를 얻으려면 침습적 검사 후 확인이 필요한 비침습적 산전 검사와는 달리, 비침습적 산전 진단(NIPD)은 침습적 절차 없이 최종 진단을 할 수 있다는 장점이 있으며, 이와 관련된 유산 위험도 있습니다. 단일 유전자 질환(SGD)의 경우 NIPD와 함께 발생합니다.

NIPD는 침습적 검사보다 임신 초기인 임신 7주부터 제공될 수 있습니다. 이를 통해 부모의 불안이 줄어들고 의사 결정 및 계획에 더 많은 시간을 할애할 수 있습니다. 실제로 SGD-NIPD에는 극복해야 할 상당한 과제가 있습니다. i/ 임신 약 4주부터 태반에서 방출되는 순환 cffDNA는 모체 혈장 내 총 순환 cfDNA의 5%-20%만을 차지합니다. 이 비율은 임신에 따라 증가하며 산모의 체중, 흡연, 자간전증과 같은 임신 합병증 등의 요인에 의해 영향을 받습니다. 결과적으로, 태아 DNA의 변이를 검출하려면 최적화된 기술과 매우 민감한 검출 접근법이 필요합니다. ii/ cffDNA가 충분한 수준으로 존재하는지 확인하고 위음성 결과를 피하기 위해 태아 분획을 계산해야 합니다. iii/ 또 다른 문제는 cffDNA의 짧은 단편 길이로, 이는 삼중 반복 및 대규모 삭제 또는 중복의 검출을 어렵게 만듭니다.

태아 성별 결정 및 태아 Rhesus D 상태 외에도, 수석 연구자 팀은 프랑스에서 처음으로 또는 부계 유전 돌연변이로 인한 상염색체 장애에 대한 임상 실습에 사용할 SGD-NIPD를 제안한 최초의 사람입니다. 모계 cfDNA의 높은 배경에서 구별됩니다. 이 분석을 위해 단일 돌연변이를 표적으로 삼는 데 액적-디지털 중합효소 연쇄 반응 또는 차세대 시퀀싱을 사용할 수 있습니다.

그러나 이 접근법은 돌연변이 특이적 발달이 필요하며 모체 DNA에 없는 점 돌연변이로 제한됩니다. X 연관 장애뿐만 아니라 부모 모두가 동일한 돌연변이를 보유하고 있는 상염색체 우성 모계 유전 또는 상염색체 열성 장애에 대한 NIPD는 더 큰 과제를 제기했습니다. 모성 돌연변이의 태아 유전을 확인하려면 정량적 접근이 필요합니다. 모체 돌연변이가 있는 상염색체 우성 질환 또는 상염색체 열성 질환에서, 모체 및 태아의 무세포 DNA에 의해 기여된 모체 혈장 내 돌연변이 대립유전자(M)의 전체 복사본과 야생형 대립유전자(N) 사이의 비율은 다음과 같을 것으로 예상됩니다. 태아의 유전자형(M/N)이 산모(M/N)와 동일하면 균형(M=N)입니다. 그러나 태아의 유전자형이 모체의 유전자형과 다르면 대립유전자 비율의 불균형이 발생합니다. 태아가 부모의 야생형 대립유전자(N/N)를 모두 물려받은 경우, 태아로부터 제공된 모체 혈장에 야생형 대립유전자의 추가 용량이 있게 되어 돌연변이 대립유전자(M<N)의 전체 복사본에서 과소대표되는 결과를 낳게 됩니다. ). 반대로, 태아가 부모 돌연변이 대립유전자(M/M)를 물려받은 경우, 태아로부터 제공된 모체 혈장에 돌연변이 대립유전자의 추가 투여량이 있을 수 있으며, 그 결과 돌연변이 대립유전자(M)의 전체 복사본이 과도하게 나타납니다. >N). 모체 혈장에서 예상되는 대립유전자 불균형의 정도는 모체 혈장의 DNA 태아 분획에 따라 달라집니다.

이러한 돌연변이 대립유전자 불균형을 검출하기 위해 정량적 상대 돌연변이 투여량(RMD) 접근법이 개발되었습니다. 이 접근법은 베타 지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈과 같은 열성 질환의 비침습적 검출뿐만 아니라 혈우병과 같은 X 연관 질환에도 적용되었습니다. 그럼에도 불구하고, 반복적인 서열, 상동성 유사유전자 및 정의되지 않은 게놈 재배열의 존재로 인해 특정 게놈 유전자좌에서 돌연변이에 대한 직접적인 조사는 어렵거나 불가능할 수도 있습니다. 더욱이, 대립유전자 불균형의 성공적인 분류는 혈액 샘플에서 이용 가능한 돌연변이 및 야생형 대립유전자의 사본에 통계적으로 의존하며, cfDNA의 매우 낮은 절대 농도로 인해 방해를 받습니다. 결과적으로 RMD 분석은 여전히 ​​개념 증명 단계에 있으며 제한된 수의 연구와 제한된 수의 환자를 대상으로 평가되고 있으며 연구자가 아는 표준 치료 진단에서는 구현된 적이 없습니다.

이러한 과제는 상대 일배체형 투여량 분석(RHDO)을 통한 간접적인 돌연변이 상태 추론을 통한 대체 솔루션에 영감을 주었습니다. RHDO에 의한 간접적인 돌연변이 상태 추론에 의한 SGD-NIPD는 지중해 빈혈에 성공적인 것으로 나타났으며 현재 낭포성 섬유증, 척수성 근위축증 및 뒤시엔 근이영양증에 대해 영국 국립 보건 서비스에서만 임상 실습 중입니다. RHDO는 신뢰성이 입증되었지만 품질 관리 및 결정 임계값은 임상 구현에서 철저하게 다루어지지 않았습니다.

수석 조사팀은 Dennis Lo가 개발한 접근 방식에서 영감을 얻었으며 통계적 오류를 포괄적으로 제어할 수 있도록 하여 방법론적 측면을 강화했습니다. ii/ RHDO의 진단 성능에 영향을 미치는 주요 매개변수를 명확하게 식별함으로써; iii/ 테스트의 전반적인 품질을 보여주는 출력 기능을 정확히 찾아냅니다.

그런 다음 이러한 모든 요소를 ​​병합하여 품질 점수와 결정 임계값을 정의했습니다.

5가지 장애에 대한 위험에 처한 90명 이상의 가족이 참여한 예비적이고 유익한 작업이 주요 조사팀에 의해 수행되었습니다.

전체적으로 워크플로는 다음과 같습니다.

구체적: 최종 테스트 중 92/92(100%) 태아 유전자형이 정확하게 식별되었습니다(예: 일치하는 결과 92개 + 불일치하는 결과 0개) 민감도: 모든 테스트 중에서 92/98(94%)의 결정적인 테스트(예: 92개의 결정적인 일치 결과 + 6개의 결정적이지 않은 일치 결과) 임상적으로 실행 가능: 처리 시간은 영업일 기준 5~6일입니다. 보편적: 모든 돌연변이 프로파일(점 돌연변이, 결실, 중복, 삼중 확장 등)에 적용 가능합니다.

적응성: 다른 SGD 테스트를 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 본 프로젝트는 이론적으로 모든 단일 유전자 질환 및 모든 가족에 대해 SGD-NIPD를 가능하게 하기 위해 독특한 프랑스 협력 네트워크를 활용하는 것을 목표로 합니다. 연구자들은 SGD-NIPD의 진단 성능에 대한 종합적인 평가를 위해 관심 있는 각 질병에 대한 워크플로를 확장하기 위해 이 예비 작업을 구축하고자 합니다. 결국, 이러한 협력적 성취는 프랑스의 산전 진단 환경을 다시 그릴 수 있게 해줄 것입니다.

본 연구에서 제안한 접근 방식의 한 가지 장점은 표적화된다는 것입니다. RHDO 분석 및 그 결과는 가족 장애와 관련된 DNA 위치에 대해 구체적이며 게놈의 다른 영역에는 영향을 미치지 않습니다. 연속적으로, 연구자는 출생 전 환경에서 전체 엑솜 또는 게놈 시퀀싱을 둘러싼 윤리적, 사회적 문제(예: 불확실한 중요성 또는 부수적 발견의 변종 식별을 통해 발생하는 상담 문제)에 직면하지 않을 것입니다.

SGD-NIPD는 HBB, CFTR, FMR1, HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 또는 ATP7A.

모집 역량은 매년 바이오의약품기관 보고서에 보고되는 희귀질환 유병률과 각 공동연구센터의 활동 등을 고려하여 평가한다.